بررسی اثر ضد میکروبی عصاره آبی و الکلی کلاله زعفران بر روی میکروب های پاتوژن دهان (استرپتوکوک موتانس، لاکتوباسیل،کاندیدا آلبیکنس)

بارانی کرباسکی, فرزانه; حسین زاده, حسین; فضلی بزاز, بی بی صدیقه; ولایتی پور, هدی; قزوینی, کیارش; عجمی, بهجت الملوک

doi:10.22038/jmds.2016.7010

بررسی اثر ضد میکروبی عصاره آبی و الکلی کلاله زعفران بر روی میکروب های پاتوژن دهان (استرپتوکوک موتانس، لاکتوباسیل،کاندیدا آلبیکنس)

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

¹ دستیار تخصصی گروه دندانپزشکی کودکان، دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، ایران

² استاد گروه فارماکودینامیک و سم شناسی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، ایران

³ استاد گروه شیمی دارویی، دانشکده داروسازی، عضو مرکز تحقیقات علوم داروئی و مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی داروئی دانشگاه علوم پزشکی مشهد، ایران

⁴ دندانپزشک

⁵ دانشیار گروه میکروبیولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، ایران

⁶ استاد گروه دندانپزشکی کودکان، دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، ایران

10.22038/jmds.2016.7010

چکیده

مقدمه: پوسیدگی دندانی یک بیماری عفونی است که میکروارگانیسم های مختلفی در ایجاد و پیشرفت آن نقش دارند. داروهایی که برای کاهش میکروب ها مورد استفاده قرار می گیرند دارای عوارض جانبی می باشند. بنابراین جستجو برای مواد ضدمیکروبی که حداقل عوارض جانبی را داشته باشند، ضروری است. لذا هدف از این مطالعه بررسی اثر ضدمیکروبی عصاره آبی و الکلی زعفران بر میکروب های بیماری زا حفره دهان می باشد.
مواد و روش ها: تعداد 6 دانش آموز پسر 9 ساله از یک دبستان انتخاب و نمونه برداری از پلاک دندانی، بزاق و عمق پوسیدگی دندانی جهت بررسی سه میکروب استرپتوکوک موتانس، کاندیدا آلبیکانس و لاکتوباسیل انجام شد و نمونه ها به آزمایشگاه ارسال شدند. پس از انجام آزمایش به روش رقیق سازی متوالی و انکوباسیون و با توجه به سختی تشخیص کدورت از 6 نمونه استرپتوکوک موتانس و 6 نمونه لاکتوباسیل و 8 نمونه قارچ کاندیدا آلبیکنس مورد آزمایش، کشت شبانه تهیه گردید و جهت تعیین Minimal Bactericidal Concentration (MBC) بررسی شد. جهت مقایسه اثر آنها از کشت مثبت پنی سیلین و نیستاتین استفاده شد. در این تحقیق برای مقایسه همه گروه ها از آزمون واریانس یک طرفه و برای مقایسه دو به دوی گروه ها از آزمون توکی استفاده گردید.
یافته ها: این مطالعه نشان داد که عصاره آبی و الکلی زعفران بر روی سه میکروب اثر مهاری داشته، اگر چه که قدرت آنها در مقایسه با آنتی بیوتیک (پنی‌سیلین) کمتر بود. مقایسه اثر عصاره الکلی و آبی زعفران و پنی‌سیلین بر روی استرپتوکوک موتانس تفاوت معنی داری نشان داد که 001/0P< بود. همچنین مقایسه اثر عصاره الکلی و آبی زعفران و پنی‌سیلین بر روی لاکتوباسیل تفاوت معنی داری نشان داد و 0001/0P< بود. تفاوت معنی داری بین نتیجه اثر عصاره الکلی و آبی زعفران و نیستاتین بر روی کاندیدا آلبیکنس مشاهده شد، و 01/0P< بود.این مطالعه نشان داد که عصاره الکلی زعفران در از بین بردن کاندیدا آلبیکنس و استرپتوکوک موتانس از عصاره آبی موثرتر است (001/0P<).
نتیجه گیری: نتایج این مطالعه حاکی ازآن است که زعفران دارای اثر باکتریواستاتیک بر روی استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیل و اثر ضدقارچی بر روی کاندیدا آلبیکنس می باشد. با توجه به منشا گیاهی و در نتیجه عوارض کمتر آن و بومی بودن و مقرون به صرفه‌تر بودن زعفران شاید بتوان این دارو را به عنوان دهان شویه توصیه نمود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of Antimicrobial effects of Aqueous and Alcoholic Extracts of Saffron on Oral Pathogenic Microbes (Streptococcus Mutans, Lactobacillus, Candida Albicans)

نویسندگان [English]

Farzaneh Barani Karbasaki ¹
Hossein Hossenzadeh ²
Bibi Sedigheh Fazli Bazzaz ³
Velayatipour Hoda ⁴
Kiarash Ghazvini ⁵
Behjat-al-molok Ajami ⁶

¹ Postgraduate Student, Dept of Pediatrics, School of Dentistry, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran.

² Professor of Pharmacodinami and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mashhad University of medical sciences, Mashhad, Iran.

³ Professor in Pharmaceutical Microbiology, Biotechnology Research Center, Department of Food and Drug Control, School of Pharmacy, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

⁴ Dentist

⁵ Associate Professor, Dept of Mycobacteriology, Ghaem Hospital, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

⁶ Professor of Pedodontics, Dep of Pediatric Dentistry, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran.

چکیده [English]

Introduction: Dental caries is an infectious disease and various microorganisms have a pivotal role in its onset and development. Medications used to reduce microbes are usually accompanied with side effects. Therefore, it seems necessary to search for antimicrobial agents with less side effects. In this study, we aimed to evaluate the antimicrobial effects of aqueous and alcoholic extracts of saffron on oral pathogenic microbes.
Materials & Methods: In total, six 9-year-old male students were selected from a primary school. Samples of dental plaque, saliva, and depth of tooth decay were obtained from the participants to evaluate Streptococcus mutans, Lactobacillus, and Candida albicans and were sent to the laboratory afterwards. After assessing the samples via broth dilution method and incubation, six samples of Lactobacillus, eight samples of Candida albicans, and six samples of Streptococcus mutans were evaluated due to difficulty in turbidity detection. Afterwards, overnight cultures were prepared and evaluated for minimal bactericidal concentration (MBC) determination. In the next stage, penicillin and nystatin positive culture tests were used to compare the effects of microbes. In this study, one-way ANOVA was used to compare all the study groups, while pairwise comparison was performed using Tukey test.
Results: Our findings were indicative of inhibitory effects of aqueous and alcoholic extracts of saffron on all three microbes. However, they were less effective compared to standard antibiotics (e.g., penicillin). A significant difference was observed between the effect of aqueous and alcoholic extracts of saffron and penicillin on the Streptococcus mutans (P<0.001). Similarly, a significant difference was found between the effects of saffron extracts and penicillin on the Lactobacillus (P<0.0001). Moreover, a significance difference was observed between extracts of saffron and nystatin on Candida albicans (P<0.001). According to the results, alcoholic extract of saffron was more successful in eliminating Candida albicans and Streptococcus Mutans, compared to aqueous extract of saffron (P<0.001).
Conclusion: According to the results, while saffron had bacteriostatic effects on Streptococcus mutans and Lactobacillus, it had antifungal activities against Candida albicans. Therefore, saffron could be recommended as a mouthwash due to its herbal origin, cost-effectiveness, and fewer side effects.

کلیدواژه‌ها [English]

Extract
Saffron
Antimicrobial
oral pathogenic microbes

اصل مقاله

مقدمه

با توجه به شیوع بالای پوسیدگی در جامعه، توجه خاص به روش های پیشگیری ضروری است. عوامل اصلی ایجادکننده پوسیدگی شامل میکروب ها، مواد قابل تخمیر و میزبان مستعد مثل دندان ها و بزاق می باشد. میکروب ها به خصوص استرپتوکوک موتانس در شروع ایجاد پوسیدگی نقش مهمی دارد، لاکتوباسیلوس ها و قارچ ها نیز در روند پوسیدگی افزایش می یابند. کاربرد عوامل ضدمیکروبی، آنتی بیوتیک و دهانشویه های آنتی میکروبیال موجود در بازار علی رغم مفید بودن عوارضی نیز دارند.⁽¹⁾ لذا استفاده از یک داروی گیاهی که دارای اثرات ضدمیکروبی بوده و عارضه نیز نداشته باشد، ضروری به نظر می رسد. زعفران یک گیاه بومی است و به دلیل خصوصیات بیولوژیک متعدد آن در دو دهه گذشته مورد مطالعه قرار گرفته است.⁽²⁾

استرپتوکوک موتانس که نه تنها در پوسیدگی دندانی نقش دارد، بلکه درایجاد بیماری های دیگری مانند شقاق گوشه لب، التهاب غده پاروتید نیز نقش دارد.⁽³⁾

لاکتوباسیلوس ها نیز در ایجاد پوسیدگی نقش دارند و از عوامل میکروبی دیگر مثل میکروب های بیهوازی ایجادکننده بیماری لثه می باشند.⁽⁴⁾

قارچ ها نیز مانند کاندیداآلبیکنس در روند پوسیدگی و بیماری لثه نقش دارند.^(5و2)

از عوامل شیمیایی و ضدپلاک که هم در درمان و هم در پیشگیری از بیماری لثه نقش دارد می توان کلرهگزیدین را نام برد. کلرهگزیدین یکی از عوامل ضدمیکروبی است و به اشکال مختلف از قبیل دهانشویه، خمیردندان و ژل عرضه می شود.⁽⁶⁾

اثرات ضدپلاک کلرهگزیدین به دلیل طبیعت دی کاتیونی مولکول کلرهگزیدین می باشد، که منجر به دوام اثر ضدمیکروبی در سطح دندان به صورت باکتریسیدال و باکتریواستاتیک می شود. همین ماهیت کاتیونی علت بیشتر عوارض جانبی همراه با مصرف این ماده یعنی تغییر رنگ خارجی دندان می باشد.⁽⁷⁾ عوارض جانبی متعددی برای کلرهگزیدین از قبیل از دست رفتن حس چشایی، احساس سوزش مخاط دهان، خشکی دهان گزارش شده است.⁽⁸⁾

بنابراین جستجو برای مواد ضدمیکروبی جدید که دارای حداقل عوارض جانبی باشند ضروری است. یکی از زمینه های امیدبخش برای جست و جوی اجزای فعال بیولوژیک جدید گیاهان مورد استفاده در طب سنتی از جمله زعفران می باشد.

زعفران کلاله خشک شده گیاه Crocus stivus L. می باشد. این گیاه به صورت رسمی در لیست داروهای چینی ثبت شده است و در طب سنتی چینی برای درمان هماتوما، منوستاز، افسردگی و تشنج به عنوان یک آرامبخش استفاده می شده است.⁽⁹⁾ مطالعات اخیر ثابت کرده اند که این گیاه پتانسیل کاهش ریسک بیماری های مختلفی را دارا می باشد.⁽¹⁰⁾ خواص دارویی متعددی برای زعفران ذکر شده است. برخی متابولیت های مشتق شده از کلاله زعفران به دلیل عملکرد هیپولیپیدمیک، ضدسرفه، آنتی اکسیدان، آنتی دیابت و ... آثار درمانی بسیاری از خود نشان داده اند. عصاره های آبی و الکلی زعفران، محافظت کننده قلب و مقابله کننده با اختلالات نورودژنراتیو هستند. خصوصیات دارویی متعدد زعفران مربوط به اجزای مختلف آن مانند Crocetin، Crocin و سایر موادی است که دارای خاصیت قوی آنتی اکسیدان و جمع آوری رادیکال های آزاد اکسیژن و سیتوکاین های پیش التهابی می باشند.⁽⁸⁾

مطالعات نشان داده ند که بیش از 150 ماده مختلف در کلاله زعفران وجود دارد. قویترین اجزای زعفران کاروتنوئیدها و آلدهیدهای مونوترپن هستند. مطالعه بر روی ارتباط عملکرد و ساختار مولکول نشان داده است که برخی ویژگی های زعفران به دلیل مشتقات دگلیکوزیله آن می باشد، و بقیه با مشتقات گلیکوزیله مرتبط می باشد.⁽¹⁾

اثرات ضدمیکروبی زعفران نیز در مطالعات متعددی مورد بررسی قرار گرفته است.⁽¹⁾ Sengul و همکارانش⁽¹¹⁾ طی بررسی های خود عنوان می کنند که زعفران می تواند منبع غنی از عوامل آنتی اکسیدان و آنتی میکروبیال باشد.

هدف از این مطالعه بررسی اثر ضدمیکروبی عصاره آبی و الکلی زعفران بر میکروب های بیماری زا حفره دهان از قبیل استرپتوکوکوس موتانس، لاکتوباسیل و کاندیداآلبیکانس بود.

مواد و روش ها

در تحقیقات میکروبی حداقل 6 سویه از هر میکروب کافی است. از طرفی به دلیل هزینه بر بودن، امکان اضافه کردن تعداد نمونه ها وجود ندارد، لذا جهت بررسی اثر عصاره آبی و الکلی زعفران، بر روی میکروب های بیماری زای دهان، تعداد 6 دانش آموز 9 ساله که هیچگونه بیماری سیستمیک نداشته از یک دبستان به طور تصادفی انتخاب گردیدند. نمونه ها از پلاک میکروبی، بزاق و پوسیدگی ناحیه دندان های مولر برداشته شد و جهت بررسی به آزمایشگاه برده شد. در هر بیمار سه میکروب استرپتوکوکوس موتانس، کاندیداآلبیکنس و لاکتوباسیل بررسی گردید، که در مجموع 18 میکروب بررسی شد.

به جای کاربرد نمونه های استاندارد، از روش نمونه گیری استفاده شد. جهت نمونه گیری از پلاک دندانی، به کمک سوند استریل از روی سمت باکال و لینگوال دندان های ناحیه خلفی پلاک برداشته شد و روی سواپ استریل قرار داده شد و سپس داخل لوله آزمایش حاوی ماده ترانسپورت قرار داده شد. جهت نمونه گیری از بزاق، سواپ آغشته به بزاق بیمار شد و روی پلیت حاوی محیط کشت مایع ترانسپورت به آرامی کشیده شد و به آزمایشگاه برده شد. سپس جهت نمونه گیری از پوسیدگی، با سوند پوسیدگی های سطحی کنار زده شد و از عمق پوسیدگی نمونه گیری انجام شد و جهت جداسازی باکتری به آزمایشگاه برده شد.

نمونه ها در محیط مایع ترانسپورت Modified Medium Stuart که دارای 10-5 گرم پپتون در لیتر بوده و سیستم بافری داشت، (باکتری ها تکثیر نیافته و از بین نمی روند) نگهداری شد و حداکثر ظرف یک ساعت به آزمایشگاه رسانده می شد.

برای جداسازی Lactobacillus spp. قسمتی از نمونه در محیط کشت مایع MRS Broth کشت گردید و به مدت 48 ساعت در 37 درجه سانتیگراد و شرایط بی هوازی نگهداری گردید. سپس از باکتری های رشد کرده در محیط MRS Broth برداشته و در محیط MRS Agar کشت داده شد. کلنی هایی که ویژگی های مورد نظر را داشت به عنوان لاکتوباسیلوس در نظر گرفته شد.

جهت جداسازی استرپتوکوک موتانس، نمونه ها در محیط استرپتوکوک سلکتیو آگار کشت و در حرارت 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت در شرایط میکروآیروفیل گرمخانه گذاری گردید.

برای جداسازی کاندیدا، نمونه ها در محیط کشت سابورو دکستروز آگار و محیط کشت رنگی کروم آگار کشت داده شد و حضور کاندیداآلبیکنز با آزمون بررسی میکروسکوپی و تولید ژرم تیوب بررسی شد.

تهیه سوسپانسیون میکروبی، پس از جداسازی میکروب ها، از همه آن ها یک کشت اولیه تهیه شد و در یخچال به عنوان منبعی برای انجام سایر آزمایشات نگهداری شد. برای انجام هر آزمایش باید میکروب جدید و تازه داشت تا مطمئن باشیم میکروب ها زنده اند.

روز قبل از آزمایش از همه نمونه های میکروبی کشت ایزوله روی محیط بلاد آگار برای استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیل، و آگار Soyabean casein) trypton soya agar) digest agar) متعلق به شرکت (Himedia) برای کاندیدا کشت داده می شد و در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد. در مورد لاکتوباسیل با توجه به اینکه میکروبی بی هوازی است، برای رشد، نیازمند محیط خاص باکتری های بی هوازی است. برای کشت بی هوازی باید میکروب ها داخل جار بی هوازی) ظرفی غیر قابل نفوذ که هیچ گونه تبادل گازی با محیط خارج ندارد و برای کشت باکتری های بی هوازی مورد استفاده قرار می گیرد (قرار داده شوند، برای ایجاد این شرایط داخل جار یک عدد گاز پک (MERCK) گذاشت، که یک کیت شیمیایی جاذب اکسیژن است، با مقدار 6 میلی لیتر نرمال سالین خیس شد و در انکوباتور 37 سانتیگراد قرار داده شد.

پس از رشد میکروب ها در این محیط های یک روزه از این میکروب ها سوسپانسیون تهیه شد. به این صورت که به کمک پیپت استریل، مقدار کمی نرمال سالین استریل روی پلیت حاوی میکروب ریخته شد و کمی با کلنی ها مخلوط گردید، سپس به یک لوله آزمایش استریل که حاوی 9 میلی لیتر نرمال سالین بود از این سوسپانسیون میکروبی اضافه شد تا غلظتی معادل استاندارد نیم مک فارلند حاصل شود.

این سوسپانسیون حاوی (Colony forming unit per milliliter)، CFU/ml 10⁸ میکروب بود. سپس روی ویبراتور سوسپانسیون همگن شد.

1 سی سی از این سوسپانسیون به وسیله پیپت استریل به 9 سی سی نرمال سالین دیگر اضافه شد و سوسپانسون میکروب CFU/ml10⁷ تهیه شد و به همین ترتیب سوسپانسیون CFU/ml 10⁶ از سوسپانسیون CFU/ml 10⁷تهیه شد.

برای تهیه عصاره الکلی به ازای هر 10 میلی گرم پودر زعفران، µ100 الکل 80 درجه در یک ارلن مایر ریخته شد. مدت 72 ساعت ارلن روی شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه قرار داده شد. در پایان 72، ساعت ابتدا محتویات ارلن از چند لایه پارچه تنظیف و سپس از کاغذ صافی عبور داده شد. عصاره حاصله پس از تغلیظ با دستگاه حذف حلال، در دمای 40 درجه سانتیگراد داخل چند پلیت ریخته شد و سپس روی بن ماری 40 درجه کاملاً خشک گردید. مقدار عصاره الکلی لازم برای رسیدن به غلظت مورد نظر روی ترازو اندازه گیری شد و در حجم مورد نظر از محیط کشت داخل لوله آزمایش حل شد. لوله آزمایش حاوی محلول عصاره الکلی روی ویبراتور ویبره شد تا به یک محلول شفاف و یکدست رسانده شود. پس از تهیه محلول با غلظت اولیه مورد نظر، سایر غلظت ها با نسبت 2/1، 2/1 داخل ویال های استریل در مجاورت شعله تهیه شد. به این صورت که 2/1 از غلظت اولیه برداشته می شد و به همین مقدار محیط کشت اضافه شد و غلظتی نصف غلظت اولیه به دست آمد و به همین صورت تا غلظت های پایین تر این کار ادامه پیدا کرد و از غلظت آخر 2/1 برداشته شد و دور ریخته شد.

برای تهیه عصاره آبی به ازای هر 10 میلی گرم پودر زعفران، 100 میلی لیتر آب مقطر استفاده شد و حل گردید. سپس برای 24 ساعت بر روی شیکر انکوباتور قرار گرفت و مواد از چند لایه پارچه تنظیف رد شدند. سپس عصاره ها در بالن ته گرد ریخته شدند و در فریزر منفی 80 درجه قرار گرفتند. پس از یخ زدن، عصاره ها در دستگاه فریز درای قرار داده شدند. (در خلا حذف حلال صورت گرفت (پس از تهیه غلظت اولیه مثل عصاره الکلی رقیق سازی سریالی با نسبت 2/1، 2/1 داخل ویال های استریل انجام شد و از غلظت انتهایی، 2/1 دور ریخته شد.

جهت مقایسه تأثیر عصاره آبی و الکلی زعفران بر روی میکروب های مورد آزمایش، از آنتی بیوتیک ضدباکتری استاندارد یعنی پنی سیلین (شرکت لقمان) و یک ضد قارچ مؤثر بر کاندیداآلبیکنس یعنی نیستاتین( شرکت جابربن حنان – تهران - ایران( استفاده شد. برای بررسی اثر آنتی بیوتیک بر این سه میکروب، غلظت هایی از پنی سیلین و نیستاتین به همان روش رقیق سازی سریالی و در محیط کشت های مناسب میکروب مورد نظر تهیه شد. پودر این داروها روی ترازو اندازه گیری شد و در محیط کشت داخل لوله آزمایش به کمک ویبراتور حل شد و با نسبت با نسبت 2/1، 2/1 سایر غلظت ها نیز تهیه شد.

روش آزمایش به صورت رقیق سازی متوالی(Serial Dilution) درون پلیت 96 خانه بود. عصاره آبی و الکلی باید داخل محیط کشت مایع حل شده و غلظت های مختلف از آن ها تهیه شود که این محیط کشت برای میکروب های مختلف متفاوت است.محیط کشت برای استرپتوکوک موتانس B.H.I.B (Brain Heart Infusion Broth)، کاندیداM.H.B (Muller Hinton Broth) و لاکتوباسیل (Brain Heart Infusion) B.H.I می باشد. همه محیط کشت ها متعلق به شرکت Himedia هندوستان بودند.

جهت انجام آزمایش از پلیت 96 خانه استفاده شد. مقدار μl 200 از هر غلظت از ماده مورد آزمایش (عصاره آبی یا الکلی) و همین طور μl200 از غلظت های مختلف پنی سیلین و یا نیستاتین جهت مقایسه اثر آنها با تأثیر عصاره آبی و الکلی داخل چاهک ها ریخته شد. و در چاهک های کنترل مثبت و منفی نیز همین مقدار از محیط کشت ریخته شد. سپس به همه چاهک ها به جز چاهک کنترل منفی مقدارμl 20 از سوسپانسیون میکروبی اضافه شد. هر آزمایش برای هر میکروب سه بار تکرار شد. برای میکروب بی هوازی لاکتوباسیل پلیت ها داخل جار بی هوازی حاوی گازپک قرار داده شد. پس از ریختن مقدار لازم از هر غلظت پلیت ها به مدت یک شب داخل انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. در این مدت از رسیدن رطوبت به میکروب ها جلوگیری شد.

برای بررسی نتایج و اینکه مشخص شود در کدام چاهک ها میکروب رشد کرده است، مقدار کدورت چاهک ها تعیین شد. به دلیل رنگی بودن مواد مورد آزمایش، تشخیص کدورت ناشی از رشد میکروب با چشم مشکل بود لذا، از غلظت های مشکوک، کشت ایزوله تهیه شد. به این صورت که در مجاورت شعله یک لوپ که روی شعله حرارت دید وارد چاهک های مورد نظر شد و روی محیط کشت آگار کشیده شد. آن گاه این محیط کشت ها، 24 ساعت داخل انکوباتور قرار داده شدند، روز بعد هر پلیتی که در آن رشد میکروب نداشت، یعنی کلنی هیچ باکتری در آن دیده نمی شد، غلظت MBC محاسبه می شد. تمامی مراحل بررسی و ثبت نتایج توسط نویسنده انجام شد.

MIC (Minimal Inhibitory Concentration)، کمترین میزان غلظت یک عامل ضدمیکروبی که از رشد میکروارگانیسم جلوگیری می کند، به عنوانMIC شناخته می شود. تست MIC ممکن است روی آگار و یا یک مایع واسط انجام شود. روش معمول تعیین MIC، تکنیک رقیق سازی متوالی است.⁽¹¹⁾

MBC (Minimal Bactericidal Concentration)، کمترین غلظت عامل ضد میکروبی که اکثر (9/99 درصد) جمعیت میکروبی تلقیح شده را از بین می برد، و در این آزمایش غلظت اولین چاهکی که در کشت ایزوله آن هیچ میکروبی رشد نیافت غلظت MBC تعیین می شد.

داده ها به صورت میانگین و انحراف معیار گزارش گردید. در این تحقیق برای مقایسه سه گروه از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه و برای مقایسه دوبه دوی گروه ها از آزمون توکی استفاده گردید. سطح معنی داری در آزمون ها 05/0 در نظر گرفته شد.

یافته ها

در این مطالعه اثر ضدمیکروبی عصاره آبی و الکلی زعفران، بر روی سه میکروب بیماری زای دهان (استرپتوکوک موتانس، لاکتوباسیلوس و کاندیداآلبیکنس) مورد بررسی قرار گرفت. میانگین MBC به دست آمده برای عصاره الکلی و آبی زعفران، پنی سیلین و نیستاتین بر حسب mg/ml در 6 نمونه استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیل و هشت نمونه کاندیداآلبیکنس در جداول 1 تا 3 آمده است.

آنالیز واریانس یک طرفه نشان داد میانگین غلظت MBC روی استرپتوکوک موتانس سه گروه تفاوت معنی داری دارند (جدول 1) آزمون توکی برای مقایسه دوبه دوی گروه ها حاکی از تفاوت بین هر سه گروه با یکدیگر بود (001/0P<).

آنالیز واریانس یک طرفه نشان داد سه گروه از نظر میانگین MBC روی لاکتوباسیل تفاوت معنی داری دارند (جدول 2) آزمون توکی برای مقایسه دوبه دوی گروه ها حاکی از تفاوت بین عصاره آبی با پنی سیلین و همچنین عضاره الکلی با پنی سیلین بود. (001/0P<) ولی عصاره آبی با الکلی تفاوت معنی داری با هم نداشت (58/0P=).

آنالیز واریانس یک طرفه نشان داد میانگین MBC روی کاندیداآلبیکانس در سه گروه تفاوت معنی داری دارند (جدول 3). آزمون توکی برای مقایسه دوبه دوی گروه ها حاکی از تفاوت بین عصاره آبی با نیستاتین (007/0P=) بود و همچنین عضاره الکلی با نیستاتین و عصاره آبی با الکلی نیز تفاوت معنی داری داشت (001/0P<).

جدول 1 : میانگین و انحراف معیار غلظت (MBC mg/m) عصاره ی آبی و الکلی زعفران و پنی سیلین روی استرپتوکوک موتانس

	میانگین	انحراف معیار	حداقل	حداکثر
عصاره آبی	3/133	82/25	100	150
عصاره الکلی	6/39	61/16	5/12	50
پنی سیلین	05/0	0	05/0	05/0
نتیجه آزمون	001/0P< 1/112F=

جدول 2 : میانگین و انحراف معیار غلظت (MBC mg/m) عصاره آبی و الکلی زعفران و پنی سیلین روی لاکتوباسیل

	میانگین ± انحراف معیار	حداقل	حداکثر
عصاره آبی	28/75±3/683	600	700
عصاره الکلی	33/121±783	600	1000
پنی سیلین	0±05/0	05/0	05/0
نتیجه آزمون	001/0P< 2/94F=

جدول 3 : میانگین و انحراف معیار غلظت (MBC mg/m) عصاره آبی و الکلی زعفران و نیستاتین روی کاندیداآلبیکنس

	میانگین ± انحراف معیار	حداقل	حداکثر
عصاره آبی	65/21±5/62	50	100
عصاره الکلی	75/51±5/337	300	400
پنی سیلین	055/0±6/2	25/1	5
نتیجه آزمون	001/0P< 3/259F=

بحث

این مطالعه نشان داد که عصاره های آبی و الکلی زعفران بر روی سه میکروب بیماری زای دهان، استرپتوکوک موتانس، کاندیداآلبیکنس و لاکتوباسیل دارای اثر ضدمیکروبی بود و بر روی هر سه میکروب اثر مهاری دارد.

MBC برای استرپتوکوک موتانس، لاکتوباسیل و کاندیداآلبیکنس محاسبه گردید. در این غلظت عصاره الکلی و آبی با پنی سیلین مقایسه شد و اثر عصاره الکلی و آبی ضعیف تر از اثر پنی سیلین بود و تفاوت آنها معنی دار بود.

کاندیداآلبیکنس جزء فلور نرمال بدن است و در حفره دهان بیش از نیمی از افراد، یافت می شود و تنها در شرایطی خاص علایم بیماری را ایجاد می کند.⁽¹²⁾ این مطالعه نشان دادکه عصاره های آبی و الکلی زعفران توانایی از بین بردن کاندیداآلبیکنس را دارند و این اثر ضعیف تر از نیستاتین بود و تفاوت معنی داری بین نتیجه عصاره الکلی و آبی و بر روی کاندیداآلبیکنس وجود داشت.

Bathaieو همکارش⁽²⁾ بیان کردند آنالیزهای شیمیایی بیش از 150 ماده مختلف را در کلاله زعفران نشان داده است قو ی ترین اجزای زعفران، کاروتنوئیدها و آلدهیدهای مونوترپن هستند.

اثر قوی آنتی‌اکسیدانی در مقابل انواع رادیکال های آزاد اکسیژن و سیتوکایین‌های پیش التهابی از خصوصیات دارویی متعدد زعفران بوده که مربوط به اجزای مختلف آن مانند Crocin و Crocetin می باشد.⁽¹⁰⁾

مطالعه Vahidi و همکارانش⁽¹³⁾ فعالیت ضدمیکروبی قوی تمام بخش های گیاه به جز برگ ها در مقابل باکتری ها و قارچ ها را نشان داد و بیان کرد که فعالیت عصاره اتیل استات کلاله زعفران، خاصیت ضدقارچ بیشتر و عصاره اتیل استات پرچم ها، خاصیت ضدباکتریایی بیشتری دارند.

Zheng و همکارانش⁽¹⁴⁾ نیز در مطالعه ای، به بررسی اجزای فعال از نظر زیستی گیاه زعفران پرداخته و نشان دادند که علاوه بر کلاله زعفران، اجزای دیگر آن مانند پوشش گل، پرچم ها، و ساقه پیازمانند گیاه دارای اثرات مفیدی می‌باشند. در این مطالعه اثرات ضدقارچی، سیتوتوکسیک، و آنتی اکسیدان پرچم، کلاله، و پوشش گل زعفران و ترکیبات شیمیایی موجود در این اجزا تعیین شدند. پرچم ها قوی ترین اثر ضدقارچی و سیتوتوکسیک را نشان دادند. هر دو قسمت پرچم و پوشش گل دارای اثرات آنتی اکسیدان قابل توجه بودند. این یافته ها بیان می کنند که پرچم و پوشش گل زعفران مانند کلاله دارای اثرات ضدقارچ، سیتوتوکسیک و آنتی اکسیدان هستند ولی این اثر در کلاله بیشتر از اجزای دیگر است.

Moghadam⁽¹⁵⁾ اثر ضدمیکروبی زعفران را بر روی هلیکوباکترپلوری و Pintado و همکارانش⁽¹⁶⁾ اثر باکتریسیدال زعفران را بر روی سالمونلا آنتریکا به اثبات رساندند.

تمامی این مطالعات موید این مطلب هستند که زعفران دارای اثرات ضدباکتریایی و قارچی است، که به دفعات ثابت شده اند. بنابراین با توجه به نتایج تحقیق حاضر شاید بتوان گفت که زعفران دارای اثر ضدمیکروبی بر روی میکروب های دهان نیز هست. پس زعفران می تواند بر روی قارچ های دهان نیز اثرگذار باشد. از آنجائی که کلرهگزیدین که امروزه به عنوان دهانشویه به کار می رود، می تواند باعث تغییر رنگ دندانی و بهم خوردن تعادل میکروبی شود، همچنین استفاده از آموکسی سیلین به عنوان آنتی بیوتیک انتخابی در مورد میکروب های دهانی سبب مقاومت میکروبی می شود، لذا استفاده از ماده دیگری که این عوارض را نداشته باشد توصیه می شود، که با تحقیقات بیشتری که انجام شده شاید بتوانیم از زعفران استفاده کنیم. نکته ای که در این مطالعه باید به آن توجه نمود این است که مقدار مؤثر عصاره آبی و الکلی بر ضد این میکروب ها در شرایط آزمایشگاهی به دست آمده است و ممکن است این غلظت در شرایط کلینیکی چنین اثری نداشته باشند. علت این امر تفاوت محیط دهان و محیط آزمایشگاه است. در محیط دهان ماتریکس بین سلولی پلاک از تأثیر مواد ضدمیکروبی موضعی روی میکروارگانیسم های پلاک جلوگیری می کند. نقش بزاق از لحاظ تغییر pH دهان و رقیق کردن ماده نیز قابل ذکر است. از طرفی حرارت دهان با درجه حرارت انکوباتور متفاوت است و وجود خون در محیط و توان اکسیداسیون و احیای متفاوت در نقاط مختلف حفره دهان نیز می تواند روی نتایج تأثیرگذار باشد.⁽¹⁷⁾

مسئله قابل توجه دیگر این است که در لوله ها و پلیت های حاوی محیط کشت، ماده ضدمیکروبی به طور مداوم در تماس با میکروب است ولی در استفاده از مواد ضدمیکروبی به صورت موضعی در دهان و دهانشویه ها، معمولاً پس از چند ثانیه غرغره کردن، ماده از محیط دهان حذف شده و عوامل موجود در دهان اثر آن را خنثی می کنند. در مطالعه حاضر عصاره های زعفران به صورت خالص استفاده شده اند و به صورت فرمولاسیون یک دهانشویه - که حاوی مواد متعدد دیگری است - به کار گرفته نشده است.

نتیجه گیری

ننایج حاصل از این مطالعه نشان داد که زعفران چه به صورت عصاره الکلی و چه به صورت عصاره آبی می تواند بر روی میکروب های بررسی شده (استرپتوکوک موتانس، لاکتوباسیل و کاندیداآلبیکنس) اثر مهارکنندگی و کشندگی داشته باشد.

لذا با توجه به گیاهی بودن منشا این دارو و بومی بودن و در نتیجه عوارض کمتر آن و مقرون به صرفه تر بودن این ماده در مقایسه با کلرهگزیدین و سایر ترکیبات آنتی باکتریال، شاید بتوان از این گیاه به صورت دهانشویه استفاده نمود، که نیاز به مطالعات بیشتری در قالب مطالعات مداخله ای می باشد.

تشکر و قدردانی

این مقاله منتج از پایان نامه دانشجویی به شماره 2625 می باشد که در معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی مشهد به تصویب رسیده است. بدینوسیله مراتب تشکر و تقدیر خود را از این معاونت داشته، همچنین از سرکار خانم ثابتی کارشناس محترم آزمایشگاه میکروبی دانشکده داروسازی کمال تشکر را داریم.

مراجع

Kandil O, Radwan NM, Hassan AB, Amer AM, el-Banna HA, Amer WM. Extracts and fractions of Thymus capitatus exhibit antimicrobial activities. J Ethnopharmacol 1994; 44(1): 19-24.
Bathaie SZ, Mousavi SZ. New applications and mechanisms of action of saffron and its important ingredients. Crit Rev Food Sci Nutr 2010; 50(8): 761-86.
Smith AJ, Jackson MS, Bagg J. The ecology of Staphylococcus species in the oral cavity. J Med Microbiol 2001; 50(11): 940-6.
Dal Bello F, Hertel C. Oral cavity as natural reservoir for intestinal lactobacilli. Syst Appl Microbiol 2006; 29(1): 9-76.
Scully C, el-Kabir M, Samaranayake LP. Candida and oral candidosis: A review: An official publication of the American Association of Oral Biologists. Crit Rev Oral Biol Med 1994; 5(2): 125-57.
Fløtra L. Different modes of chlorhexidine application and related local side effects. J Periodontal Res 1973; 8: 41-4.
Jones CG. Chlorhexidine: Is it still the gold standard? Periodontol 2000. 1997; 15: 55-62.
Hepso HU, Bjornland T, Skoglund LA. Side-effects and patient acceptance of 0.2% versus 0.1% chlorhexidine used as post-operative prophylactic mouthwash. Int J Oral Maxillofac Surg 1988; 17(1): 17-20.
Tang W, Eisenbrand G. Chinese drugs of plant origin chemistry, pharmacology, and use in traditional and modern medicine. 1^st ed. Springer Berlin Heidelberg; 1992. P. 395-8.
Poma A, Fontecchio G, Carlucci G, Chichiricco G. Anti-inflammatory properties of drugs from saffron crocus. Antiinflamm Antiallergy Agents Med Chem 2012; 11(1): 37-51.
Sengul M, Yildiz H, Gungor N, Cetin B, Eser Z, Ercisli S. Total phenolic content, antioxidant and antimicrobial activities of some medicinal plants. Pak J Pharm Sci 2009; 22(1): 102-6.
Miller CH, Palenik CJ. Infection Control and Management of Hazardous Materials for the Dental Team. 2^nd ed. Elsevier Health Sciences 1998. P. 21.
Vahidi H, Kamalinejad M, Sedaghati N. Antimicrobial Properties of Croccus sativus L. Iran J Pharm Res 2002: 33-5.
Zheng CJ, Li L, Ma WH, Han T, Qin LP. Chemical constituents and bioactivities of the liposoluble fraction from different medicinal parts of Crocus sativus. Pharm Biol 2011; 49(7): 756-63.
Moghaddam MN. In vitro antibacterial activity of saffron (Crocus sativus L.) extract and its two major constituents against Helicobacter pylori. Planta Med 2010; 76(12): P. 496.
Pintado C, de Miguel A, Acevedo O, Nozal L, Novella JL, Rotger R. Bactericidal effect of saffron (Crocus sativus L.) on Salmonella enterica during storage. Food Control 2011; 22(3): 638-42.
Newman MG, Takei HH,Carrenza FA. Carranza's Clinical Periodontology. 10^th ed. Newman MG, Takei HH, Klokkevold PR, Carranza FA, editors. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2006. P. 42.