نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار گروه بیماریهای دهان، فک و صورت دانشکده دندان پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، ایران
2 متخصص بیماریهای دهان، فک و صورت
3 استاد بیماریهای دهان، فک و صورت، مرکز تحقیقات دندان پزشکی، دانشکده دندان پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی همدان، ایران
4 دندانپزشک
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Viewing to the increased incidence of candidiasis, the bitter taste of nystatin, and the need for its repeated administration, the role of medicinal plants as well as global trends in herbal medicine, the present study was performed to compare the inhibitory effect of Thymus eriocalyx and Thymus kotschyanus with nystatin on the growth of Candida albicans.
Materials & Methods: In this in vitro study the minimum inhibitory and fungicidal concentration of essential oils of Thymus eriocalyx and Thymus kotschyanus on the growth of Candida albicansans was determined and then the diameter of growth inhibition of the two plants adjacent minimum inhibitory and fungicidal concentration were compared with inhibition zone of nystatin. Data was analysed by SPSS using one-way ANOVA at the significance level of 0.05.
Results: In this study the minimum inhibitory concentration of plant Thymus eriocalyx and Thymus kotschyanus was 4.2 μl/ml and 3.3 μl/ml respectively and minimum fungicidal concentrations of these two plants, was 4.2μl/ ml and 4 μl/ ml, respectively. The diameter of growth inhibition zone of Thymus eriocalyx in MIC and MFC was 19.5 mm and 18.95 mm; respectively. These diameters were 18.4 mm and 21.05 mm for Thymus kotschyanus in MIC and MFC; respectively. The results of statistical analysis showed no significant difference between the diameter of growth inhibition zone of essential oils and nystatin (P>0.05).
Conclusion: Based on the results of present study, the essential oil of Thymus eriocalyx and Thymus kotschyanus have appropriate inhibitory effects on the growth of the Candida albicans. The inhibitory effect of these essential oils is comparable with nystatin.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
کاندیدا مخمر گرد و بیضی شکل با قطر 3 تا 30 میکرومتر است. تولید مثل آن غیرجنسی و از طریق فرایند جوانه زدن است.(1) کاندیدا شامل 150 گونه می باشد(2) که تنها تعداد کمی از انوع آن از بدن انسان جدا شده است.(3) در افراد سالم کاندیدا عمدتاً در سطوح مخاطی حفره دهان، دستگاه گوارش، دستگاه ادراری و واژن بدون ایجاد بیماری، کلونیزه می شود.(4)
کاندیدا جزء فلور طبیعی دهان است و در 20-50 درصد از جمعیت سالم وجود دارد.(5) این میکروارگانیسم از بسیاری از انواع قارچ های موجود در حفره دهان شایع تر است و از گونه های کاندیدای جدا شده در حفره دهان می توان به کاندیدا آلبیکنس، کاندیدا تروپیکالیس، کاندیدا پاراپسیلوزیس، کاندیدا کروزئی، کاندیدا گوئیلیرموندی، کاندیدا گلابراتا، کاندیدا دابلینینسیس و کاندیدا لوزیتانیه اشاره کرد.(1) دهان به واسطه وجود مواد غذایی، دبری های اپی تلیالی و مواد ترشحی، محیطی مطلوب برای زندگی گروه وسیعی از میکرو ارگانیسم ها فراهم می آورد.(6) عفونت کاندیدایی در صورت وجود عوامل مستعدکننده موضعی یا سیستمیک برای رشد قارچ، به صورت یک عفونت فرصت طلب تظاهر می یابد.(5) حدود 96 درصد از قارچ های فرصت طلب، ناشی از گونه های کاندیدا هستند(4)، به طوری که بیشترین عفونت های سطحی و مخاطی در انسان به وسیله کاندیدا آلبیکانس ایجاد می شوند.(7) کاندیدا آلبیکنس دارای فاکتورهای پاتوژنسیتی است که باعث رشد بیشتر این گونه نسبت به سایر گونه های کاندیدا می شود.(1) افزایش شیوع کاندیدیازیس به استفاده وسیع از آنتی بیوتیک ها و داروهای ایمونوساپرسیو نسبت داده شده است. در این میان کاندیدا آلبیکنس نقش مهمی را در کاندیدیازیس دهانی، دنچر استوماتیت و پریودنتیت شدید ایفا می کند.(8)
برای درمان عفونت های کاندیدایی بسته به وسعت ضایعه و وضعیت بیمار از درمان های موضعی یا سیستمیک استفاده می شود.(9) از جمله درمان های مورد استفاده در عفونت های کاندیدیازیس می توان به آمفوتریسین B، آزول ها و پلی ان ها اشاره کرد.(10) نیستاتین یک آنتی بیوتیک پلی ان ((Polyene است که استفاده گسترده ای دارد. زیرا علیه بسیاری از قارچ های بیماری زا مانند کاندیدا و آسپرژیلوس بسیار مؤثر است. استفاده از آن در سال های اخیر در نتیجه افزایش قابل توجه در عفونت های قارچی، افزایش یافته است. دهانشویه های حاوی این دارو برای پیشگیری و درمان عفونت های قارچی به ویژه برای بیماران مبتلا به کاندیدیازیس دهانی استفاده می شود. اگر چه نیستاتین در درمان کاندیدیازیس دهانی به عنوان داروی انتخابی در نظر گرفته می شود، اما می تواند سبب برخی مشکلات قابل توجه از جمله آسیب کلیه شود.(9) هم چنین نیستاتین می تواند باعث تهوع، استفراغ و اسهال شود.(10) طعم تلخ دهان شویه نیستاتین و هم چنین احتمال افزایش بروز پوسیدگی دندانی به علت افزودن شیرین کننده ها منجر به عدم رضایت بیماران می شود.(11)
جنس آویشن یکی از جنس های مهم خانواده نعناع و از مشهورترین جنس های متعلق به گیاهان اسانس دار است.(12) آویشن یکی از مهم ترین گیاهان دارویی ایران است، که به دلیل داشتن دو ترکیب تیمول و کارواکرول دارای خواص دارویی ضدمیکروبی، ضدباکتریایی و ضدنفخ می باشد. جنس آویشن (Thymus L) به جهت دارا بودن اسانس های روغنی، کاربردهای وسیعی در صنایع دارویی و غذایی دارد.(13)
اسانس گل و برگ این گیاهان دارای اثر ضداسپاسم، ضدنفخ، ضدروماتیسم و ضدعفونی کننده قوی می باشد. در داروسازی از اسانس آویشن برای تهیه محلول های دهان شویه و شربت های ضدسرفه استفاده شده است.(13)
در سال های اخیر علاقه فزاینده ای به استفاده از ترکیبات طبیعی و گیاهی به وجود آمده و ابهامات مربوط به ایمن بودن داروهای سنتتیک باعث علاقه به مطالعات بیشتر در مورد منابع گیاهی شده است.(14) جایگاه گیاهان دارویی در طب سنتی کشور ما و دسترسی به منابع غنی گیاهی از یک سو و مشکلات موجود در درمان کاندیدیازیس دهانی از سوی دیگر عاملی برای بررسی دقیق تر داروهای گیاهی بوده است.(15) بنابراین کشف گیاهان دارویی که تأثیرات ضدمیکروبی داشته باشند، برای کاهش عوارض جانبی و کم کردن اثرات سمی روی بافت ها و همچنین از لحاظ صرفه اقتصادی بسیار مورد توجه است.(16)
با توجه به گرایش جهانی به طب گیاهی در سال های اخیر و خواص آنتی بیوتیکی آویشن و از آن جایی که گونه های مختلف این گیاه در مناطق غربی ایران در دسترس می باشد(13)، مطالعه حاضر با هدف مقایسه اثر مهاری اسانس گیاهان آویشن مرتعی و آویشن کوهی با نیستاتین بر رشد کاندیدا آلبیکنس انجام شد.
مواد و روش ها
مطالعه حاضر از نوع تجربی-آزمایشگاهی بود، که به منظور مقایسه اثر مهاری اسانس گیاهان آویشن مرتعی و آویشن کوهی با نیستاتین بر رشد کاندیدا آلبیکنس انجام شد. به جهت انجام مطالعه، گیاهان آویشن مرتعی و آویشن کوهی از باغ گیاهان دارویی بوعلی سینا در اردیبهشت سال 93 تهیه گردید.
نمونه های گیاهی از سر شاخه های گیاهان (شامل گل و برگ ها) در مرحله گل دهی از باغ گیاهان دارویی مرکز تحقیقات کشاورزی همدان جمع آوری شد، و بعد از جدا کردن خار و خاشاک، برای مدتی در محیط آزمایشگاه (در سایه) قرار داده شدند؛ تا خشک گردند. تهیه اسانس به روش تقطیر با بخار آب (Hydrodistillation) توسط دستگاه کلونجر (ایران، تهران، امیل پیرکس) انجام گرفت. به علت فرار بودن اسانس گیاه، دقایقی قبل از شروع کار، مقدار 100 گرم از سرشاخه های خشک و پاک شده گیاهان جمع آوری شده، با آسیاب برقی خرد شد. گیاه پودر شده داخل بالن ژوژه دستگاه کلونجر ریخته و به آن 700 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد. جریان آب سرد برقرار و فرآیند تقطیر به مدت دو ساعت انجام شد. بعد از دو ساعت، هیتر دستگاه خاموش شده و حجم اسانس جمع شده با کمک درجات روی بورت دستگاه، مشخص و یاداشت شد. آب زدایی توسط سدیم سولفات فاقد آب انجام گرفت و سپس اسانس ها در ویال های سیل شد. جمع آوری شد و تا زمان استفاده در مکان تاریک و در دمای اتاق نگه داری شد. اسانس های تهیه شده جهت استریلیزاسیون برای 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گراد در اتوکلاو (ایران، اصفهان، فراز مهر) قرار داده شد.
کاندیدای مورد استفاده در مطالعه حاضر سویه استاندارد کاندیدا آلبیکنس (ATCC5982) بود که از مرکز کلکسیون قارچ ها و باکتری های صنعتی و عفونی ایران (وابسته به سازمان پژوهش های علمی و صنعتی کشور) تهیه شد. کشت قارچ ها در محیط سابرو دکستروز آگار (SDA) Merk, Darmstadt, Germany) انجام شد. طبق دستورالعمل تهیه محیط کشت پیشنهادی کارخانه، 65 گرم از پودر محیط کشت با دقت وزن گردید. نصف حجم آب مورد نیاز جهت انحلال پودر محیط کشت SDA (cc500) داخل ظرف ریخته شد و سپس مقدار وزن شده پودر مذکور، به آن اضافه گردید. محلول مذکور 4 دقیقه به تندی تکان داده شد و سپس 500 میلی لیتر آب اضافه شد.
محیط کشت تهیه شده، برای 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گراد در اتوکلاو قرار گرفت و بعد از استریلیزاسیون، زمانی که دمای محیط کشت به حدود 50 درجه سانتی گراد رسید، با رعایت شرایط آسپتیک در ظروف نهایی تقسیم گردید.
جهت تهیه سوسپانسیون قارچی با غلظت استاندارد، زنجیره های قارچی درون سرم فیزیولوژی غوطهور شدند و دانسیته سلول های قارچی با استفاده از روش اسپکتروفتومتری تنظیم شد. جهت تنظیم دانسیته مناسب از دستگاه اسپکتروفتومتری (UK، Staffordshire، JENWAY) در طول موج 530 نانومتر استفاده شد. جهت کسب سوسپانسیون قارچی با غلظت 5/0 مک فارلند که حاوی cell/ml 108×5/1-1 است و غلظتی استاندارد جهت بررسی آثار ضدقارچی است؛ کدورت سوسپانسیون قارچی به نحوی تعیین شد، که میزان جذب نوری در طول موج 530 نانومتری دستگاه اسپکتروفوتومتر، معادل 1/0-08/0 باشد.
جهت اندازه گیری حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) روشBroth microdilution برای رقیق سازی اسانس ها به کار برده شد. برای رقیق سازی اسانس ها محلول رقیق کننده Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) (Sigma, St.Louis, USA) بافر شده با
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) (Sigma, St.Louis, USA) که بر قارچ مورد مطالعه هیچ اثری ندارد، استفاده شد. اسانس ها با حلال به نحوی رقیق شدند که رقت آن ها از µl/ml16 تا µl/ml 06/0 باشد.(17)
طبق پروتکل، رقت های سریالی، در میکروپلیت های 96 خانه ای (تصویر 1) به حجم 100 میکرولیتر برای هر چاهک تهیه شد، به طوری که چاهک اول حاوی بیشترین غلظت (µl/ml 16) و چاهک آخر حاوی کم ترین غلظت (µl/ml 06/0) اسانس بود. در ادامه 1/0 میلی لیتر از سوسپانسیون تلقیحی نهایی به هر چاهک اضافه شد. به عنوان کنترل مثبت (Growth control) از 1/0 میلی لیتر سوسپانسیون میکروبی درون محلول رقیق کننده بدون اضافه کردن اسانس و به عنوان کنترل منفی
(Sterility Control) از 200 میکرولیتر محلول تلقیح نشده استفاده شد. در ادامه میکروپلیت ها در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت انکوبه شدند.
تصویر 1 : میکروپلیت 96 خانه ای
جهت خواندن نتایج [1]MIC از روش چشمی (Visual) استفاده شد. در این روش MIC یعنی پایین ترین غلظت دارویی که بعد از 48 ساعت انکوباسیون هیچ رشد قارچ قابل مشاهده ای در مقایسه با رشد قارچ حفره کنترل رشد (Growth control) در آن دیده نشد و کدورت آن از لحاظ چشمی معادل حفره کنترل منفی بود، تعیین گردید.
جهت تعیین حداقل غلظت کشندگی قارچ [2](MFC) از محتویات چاهک های مختلف که حاوی غلظت های کمتر اسانس بوده و رشد کاندیدا در آن مشاهده نشده بود، 10 میکرولیتر به محیط SDA برده شد و کمترین غلظتی از اسانس که رشد کمتر از 4 کلونی (نشانگر کشتن 99 درصد قارچ های اولیه) را نشان داد، به عنوان MFC در نظر گرفته شد.
برای بررسی هاله عدم رشد از روش دیسک گذاری استفاده شد. پلیت هایی (با قطر 8 سانتی متر) با 10 میلی لیتر از محیط کشت سابرو دکستروز آگار (SDA) پر شد. 100 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی تهیه شده از کشت تازه کاندیدا آلبیکنس، 48 ساعته در سرم فیزیولوژی یا آب مقطر به کدورت معادل نیم مک فارلند با استفاده از سواپ پنبه ای استریل، روی سطح پلیت ها به طور یکنواخت تلقیح گردید. دیسک های بلانک در 10 میکرولیتر از هر اسانس در دو غلظت MIC و MFC هر دو گیاه مورد آزمایش تعلیق شد و روی پلیت ها قرار داده شدند؛ همین کار برای نیستاتین با غلظت µg/ml 42 که معادل MIC نیستاتین در محیط کشت کاندیدا آلبیکنس بوده است، هم انجام گرفت. نیستاتین با غلظت µg/ml 42 از شرکت جابر بن حیان (ایران، تهران) تهیه گردید. یک دیسک در 10 میکرولیتر از محلول رقیق کننده جهت تست کنترل منفی تعلیق شد و بر روی پلیت قرار داده شد. پلیت ها به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شد و پس از گذشت زمان مورد نظر، تشکیل هاله عدم رشد در پیرامون دیسک ها مورد بررسی قرار گرفت. قطر هاله عدم رشد با خط کش بر حسب میلی متر اندازه گیری شد (تصویر2). هاله عدم رشد MIC و MFC هر دو گیاه و هم چنین نیستاتین به وسیله 10 دیسک بررسی و میانگین آن ها محاسبه شد. داده ها توسط نرم افزار SPSS و آزمون آنالیز واریانس یک سویه در سطح معنی داری 05/0=P ارزیابی شد.
تصویر 2 : قطر هاله عدم رشد
یافته ها
در این مطالعه، حداقل غلظت مهاری برای گیاه آویشن مرتعی، µl/ml 2/4 و برای گیاه آویشن کوهی، µl/ml 3/3 به دست آمد؛ هم چنین طبق نتایج مطالعه حاضر میزان حداقل غلظت کشندگی قارچی گیاه آویشن مرتعی،
µl/ml 2/4 و گیاه آویشن کوهی، µl/ml4 بود.
جدول 1، میانگین هاله عدم رشد در اطراف دیسک های آغشته به اسانس گیاهی در دو غلظت MIC و MFC و نیز دیسک های حاوی نیستاتین را نشان می دهد. بیشترین هاله عدم رشد مربوط به داروی نیستاتین و کمترین آن مربوط به حداقل غلظت مهاری (MIC) آویشن کوهی بوده است.
نتایج آنالیز واریانس یک سویه جهت مقایسه میزان هاله عدم رشد در اطراف دیسک های آغشته به داروی نیستاتین و گیاهان مورد بررسی در دو غلظت MIC، MFC نشان دهنده عدم تفاوت معنی دار در قطر هاله عدم رشد عصاره های گیاهان مورد بررسی بود (724/0P=).
جدول 1 : میانگین، انحراف معیار، حداقل و حداکثر هاله عدم رشد کاندیدا آلبیکنس در محیط کشت سابرو دکستروز آگار در مجاورت نیستاتین و اسانس های گیاهی بر حسب میلی متر
|
متغیر |
میانگین |
انحراف معیار |
کمینه |
بیشینه |
نتیجه آزمون آنالیز واریانس |
|
هاله عدم رشد نیستاتین |
35/21 |
54/5 |
15 |
5/30 |
516/0F= 724/0P= |
|
هاله عدم رشد اطراف دیسک های آغشته به گیاه آویشن مرتعی در غلظت MIC |
50/19 |
77/5 |
12 |
29 |
|
|
هاله عدم رشد اطراف دیسک های آغشته به گیاه آویشن کوهی در غلظت MIC |
40/18 |
01/4 |
11 |
25 |
|
|
هاله عدم رشد اطراف دیسک های آغشته به گیاه آویشن مرتعی در غلظت MFC |
95/18 |
63/5 |
10 |
28 |
|
|
هاله عدم رشد اطراف دیسک های آغشته به گیاه آویشن کوهی در غلظت MFC |
05/21 |
13/7 |
14 |
35 |
بحث
بر اساس نتایج به دست آمده از این تحقیق، اسانس آویشن مرتعی و آویشن کوهی در غلظت های حداقل مهاری و قارچ کشی، اثر بازدارنده بر روی رشد کاندیدا دارند. این نتیجه هم راستا با نتایج برخی دیگر از مطالعات(21-18) می باشد که همگی اثر مهاری Thymus vulgaris بر کاندیدا آلبیکنس را تایید نموده اند. هدف مطالعه حاضر مقایسه اثر اسانس این دو گیاه با نیستاتین به عنوان استاندارد عفونت دهانی کاندیدا آلبیکنس بود.
در این مطالعه، حداقل غلظت مهاری و قارچ کشی اسانس گیاهان آویشن مرتعی و آویشن کوهی به روش Broth microdilution بر رشد کاندیدا آلبیکنس بررسی گردید. قبل از معرفی روش Broth microdilution، روش غالب Macrodilution بوده است. این دو روش از جنبه های مختلف از جمله محیط کشت و زمان مورد نیاز متفاوت هستند. مطالعات مختلف برتری و دقت بیشتر روش Broth microdilution را اثبات کرده اند. به همین دلیل در این مطالعه از روش Broth microdilution استفاده گردید.(22)
یافته های مطالعه حاضر نشان داد که حداقل غلظت مهاری و قارچ کشی آویشن مرتعی و آویشن کوهی به ترتیب 2/4 و 3/3 بود. در مطالعه نائینی و همکارانش(23) حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت قارچ کشی آویشن کوهی بر روی سوش استاندارد کاندیدا آلبیکنس به روش macrodilutionBroth، µg/ml 300 محاسبه گردید. با توجه به وزن مولکولی اسانس تهیه شده و مقادیر ماده مؤثر این اسانس ها، مقادیر به دست آمده در مطالعه حاضر با مقادیر مطالعه نائینی همسو می باشد.
مطالعه امینی و همکارانش(24) مهار رشد 100 درصد پاتوژن های مورد بررسی به وسیله اسانس آویشن کوهی در غلظت µl/l200 را نشان داد. پاتوژن های مورد بررسی در این مطالعه Pythium aphanidermatum،Rhizoctonia solani ، Fusarium graminearum وsclerotiorum Sclerotinia بودند. رسولی و همکارانش(25) حداقل غلظت مهاری و قارچ کشی اسانس آویشن مرتعی بر آسپرژیلوس نیجر را به ترتیب ppm 125 و ppm250 محاسبه نمودند. به نظر می رسد تفاوت های موجود در مقادیر گزارش شده در غلظت های MIC و MFC در مقالات مختلف، ناشی از تفاوت بین سوش های بررسی شده در تحقیقات مختلف است.
در مطالعه دیگری، نشان داده شده است که حضور مقادیر متوسط از اسانس آویشن ولگاریس کموتایپ تیمول (01/0، 1/0، 2/0، 3/0 μg/ml) و آمفوتریسین B در محیط کشت، در کاهش 80 درصد حداقل غلظت مهاری آمفوتریسین B نقش دارد. این مطالعه، اسانس های کموتایپ تیمولی یا عصاره متانولی گیاه آویشن جهت بررسی اثربخشی در مهار رشد کاندیدا استفاده شد؛ که وجود همین دو نوع ماده شیمیایی با خواص آنتی میکروبیال می تواند باعث تفاوت در نتایج مطالعات فوق با مطالعه حاضر باشد.
آویشن دارای گونه های متعددی است، که از میان گونه های آویشن 18 گونه در ایران شناسایی شده است. Thymus vulgaris یکی از مهم ترین گونه های جنس آویشن است؛ خاصیت ضدباکتری و ضدقارچی این گونه به اثبات رسیده است. تیمول و کارواکرول از اجزای اصلی آویشن (Thymus) هستند. با توجه به منابع، هر دوی این مواد جزء ترکیبات فنلی، دارای ساختمان شیمیایی یکسان و از عوامل قوی ضدمیکروبی هستند. به نظر می رسد تیمول نسبت به کارواکرول نقش مهمتری در افزایش خاصیت ضدمیکروبی ایفا می کند. هم چنین ثابت شده است که واکنش اجزای اسانس با یکدیگر نقش مهمی در تعیین اثر ضدمیکروبی گیاه ایفا می کند. تیمول و کارواکرول دارای اثرات سینرژیستی می باشند.(27)
نتیجه گیری
بر اساس یافته های مطالعه حاضر، اسانس دو گیاه آویشن مرتعی و آویشن کوهی در حداقل غلظت مهاری رشد کاندیدا آلبیکنس و حداقل غلظت قارچکشی آن، دارای اثر مهاری مناسبی بر روی رشد قارچ کاندیدا آلبیکنس می باشد. یافته های این مطالعه نشان می دهد که اثر مهاری اسانس این دو گیاه در محیط آزمایشگاه قابل مقایسه با نیستاتین است.
تشکر و قدردانی
مقاله حاضر برگرفته از پایان نامه خانم آزاده مدنی پور به شماره 764 جهت دریافت دکتری عمومی دندانپزشکی، که با حمایت معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی همدان، انجام شده است، استخراج گردیده است. بدین وسیله نویسندگان مراتب تقدیر خود را از آن معاونت محترم اعلام می دارند.
)