نویسنده
دانش آموخته کارشناسی ارشد، گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاداسلامی، واحد قم، ایران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسنده [English]
Introduction: Medicinal application of plants has been after used for the treatment of different diseases throughout human history. There is an increasing need for antiviral drugs since the treatment of viral infections with the available antiviral drugs often leads to the problem of viral resistance. In the present study, Echinacea purpurea plant with ethnomedical background was tested for its inhibitory effect on HSV-1 multiplication at different exposure times.
Materials & Methods: Root part of Echinacea purpurea plant was extracted with decoction method to obtain crude aqueous extract. This extract was screened for its cytotoxicity against Hep II cell line by CPE assay. Antiviral property of the plant extract was determined by Neutralization Test (NT) at one, two and three hours after extract oxposufe following inoculation of HSV-1.
Results: Echinacea purpurea plant did not have toxic effect at 50-900 μg/ml concentrations to the cell lines used. Findings indicated that plant extract had the highest inhibitory property when used one hour after virus inoculation that was completely inhibitory for virus replication in concentrations500-900μg/ml, but this anti-herpes specificity decreased in two and three hours.
Conclusion: Echinacea purpurea extract exhibited significant antiherpes effect on HSV-1 at nontoxic concentrations to the cell line used. Further research is needed to find action the mechanism of this plant before it could be used in conformation of antiherpes drugs.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
کاربرد داروییگیاهان در زندگی انسان برای درمان بیماریهای گوناگون، در دست نوشتههای گذشتگان بسیار یاد شده است. یافتههای به دست آمده از انسان یخی یافت شده در کوههای آلپ (5300 سال پیش از میلاد) نشانگر کاربرد داروهای گیاهی برای درمان انگل روده میباشد.(1) بر پایه برآورد سازمان جهانی بهداشت (WHO)، 80 درصد مردم جهان داروهای گیاهی را، به دلیل گران بودن داروهای شیمیایی برای درمان بیماریها به کار میبرند.(2) هم چنین در ساختار 30 درصد داروهای نوین امروزی از گیاهان دارویی بهره گرفته شده است.(5-3)
تمدن باستانی ایران هم پیشینهای دیرینه در زمینه آشنایی و درمان با گیاهان دارویی دارد و دردست نوشتههای دانشمندان ایرانی مانندابن سینا و زکریای رازی کاربرد گیاهان دردرمان بیماریهای گوناگون به چشم میخورد.(6)پژوهشهای نوین هم نشانگر اثر ضدویروسی گروهی از گیاهان دارویی میباشد(8و7)واین ویژگی درگیاهان دارای تانن، ترپنوئید، آلکالوئید و فلاونوئید به چشم میخورد.(10و9) در این باره میتوان از گیاه چای سبز نام برد که فلاونوئیدهای این گیاه اثر ضدویروسی بر روی ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV)(11)و ویروس سین سیشیال تنفسی (RSV)(12)دارند. ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 به فراوانی در میان انسانها دیده میشود و دارای میزبانهای زیادی است. این ویروس باعث آلودگیهای پوستی و مخاط دهان، گلو، مری و چشم میشود و ویروس در برخورد مستقیم فرد آلوده با فرد سالم از راه زخمهای پوستی یا لایههای مخاطی (همانند دهان یا اندام تناسلی) منتقل میشود. امروزه درمان آلودگیهای ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 با داروهای شیمیایی امروزی، به دلیل پیدایش مقاومت دارویی در ویروس مانند مقاومت HSV به آسیکلوویر در پی جهش رخ داده در ژن TK ویروسی یا ژن DNA پلیمراز ویروسی(15-13)، دوره نهفتگی آن در بدن میزبان و برگشت بیماری، با چالشهایی روبرو گردیده است. پس بایستی در پی یافتن داروهای ضدهرپسی نوین
باشیم(18-16) و گیاهان دارویی میتوانند یک راهکار تازه برای درمان بیماریهای این ویروس باشند.(19)
در این مقاله پژوهشی اثر ضدویروسی گیاه سرخارگل از تیره کاسنی، گونه پورپورا (Echinacea purpurea) در زمانهای گوناگون اثردهی عصاره پس از تلقیح ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 بر روی کشت یاختهای Hep-2 بررسی گردید. این گیاه بومی آمریکای شمال شرقی و مرکزی است. سرخارگل گیاهی چند ساله و پایا است که بخش داروییش ریشه و ساقه زیرزمینی آن میباشد. گلها به رنگ ارغوانی، زرد و نارنجی دیده میشوند. ریشه و پیکر رویشی این گیاه دارای مواد ارزشمندی مانند آلکیلآمیدها، ایزوبوتیل آمید، اسید شیکوریک، کافتاریک اسید، اکیناکوزید، پلی استیلنهای آنتی بیوتیک، اینولین، کافئیک و فورلیک اسید، پلی ساکاریدها، روغن فرار و آمیدها است. همچنین سرخارگل دارای اسانس هم میباشد که مهمترین ترکیبهای سازنده آن هومولن، کاریوفیلن و اکسید کاریوفیلن است. در گذشته سرخ پوستان آمریکایی گیاه سرخارگل را برای درمان مارگزیدگی، تب و زخمهای کهنه به کار میبردند.(20) دم کرده آن در پزشکی سنتی برای سرخک، سرماخوردگی، آلودگیهای قارچی، درمان دملها، جوش، آلودگی باکتریایی، تب خالها، دیفتری، ایدز، مالاریا و سیفیلیس به کار میرود.(6) در پزشکی نوین سرخارگل از گیاهان دارویی برگزیده سازمان بهداشت جهانی (WHO) است که به دلیل ویژگی ضدسرماخوردگی و درمان بیماریهای دستگاه تنفسی و ادراری آن میباشد.(21) سرخارگل در 50 سال گذشته برای داشتن ویژگی ضدویروسی، ضدقارچی و ضدباکتریایی خود در جهان شناخته شده است(22و20) و کاربرد این گیاه برای مارگزیدگی و سیاه زخم ثابت شده است.(23)
مواد و روشها
گیاه سرخارگل(Echinacea purpurea)از پژوهشکده گیاهان دارویی کرج فراهم گردید و به تایید کارشناس گیاه شناسی دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی شهیدبهشتی رسید. بخش ریشه آن جداگانه در دمای اتاق خشک گردید و سپس با آسیاب به صورت گرد در آورده شد. 100 گرم از گرد گیاه به 100 میلی لیتر آب مقطر افزوده شد و برای 10 دقیقه جوشانده شد و با کاغذ صافی پالایه شد.(25و24) عصاره پالایه شده در دستگاه فریزدرایر خشک گردید.(27و26) از عصاره گیاهی خشک شده محلول کاربردی با غلظت μg/ml1000 با استفاده از محیط کشت DMEM (Dulbeco's modified Eaggle medium)فراهم گردید و تا زمان آزمایش در یخچال نگهداری شد.
هرپس سیمپلکس ویروس تیپ 1 سویه KOS به عنوان یک ویروس دارای ژنوم DNA دو رشتهای و دودمان یاختهای Hep-2 برای کشت ویروس به کار برده شدند. کشت یاختهای Hep-2 و ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 از آزمایشگاههای ویروسشناسی دانشکده بهداشت، دانشگاه علوم پزشکی تهران فراهم گردید.
با فراهم کردن کشت یاختهای Hep-2با روش پاساژ دادن و بردن ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 بر روی آن شمار زیادی ویروس برای بررسی عیار ویروس به دست میآید. هنگامی که اثر سایتوپاتیک ویروسها بیش از 80% تک لایه یاختهها را فراگرفت، ویروسها برداشت شدند و سپس با روش TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose) عیار ویروس سنجیده شد.(28)اندازهای از ویروس که توانسته بود 50% یاختههای Hep-2 را آلوده کند، عیار ویروس با روش TCID50 به شمار میآید.
نخست یاختههایHep-2 در میکروپلیت 96 خانه کشت داده شدند و پس از این که تک لایه کاملی از یاختهها پدیدار شد، رقتهای گوناگونی از عصاره گیاهی سرخارگل (50، 100، 200، 300، 400، 500، 600، 700، 800 و 900 μg/ml) در محیط کشتDMEM دارای 10 درصد سرم جنین گوساله (FCS) به یاختهها افزوده گردید و در چاهک کنترل یاخته تنها محیط کشت ریخته شد. در پایان پلیت آماده شده در گرمخانه 0C37 گذاشته شد و تا یک هفته هر روز اثر توکسیسیته عصاره گیاه به صورت CPE (Cytopathic effect) از دید میکروسکوپی بررسی گردید. این ویژگی به صورت آسیب ندیدن یاختهها بدون نشان دادن اثر سایتوپاتیک عصاره بر روی آنها دیده میشود.
نخست یاختههایHep-2 در میکروپلیت 96 خانه کشت داده شدند و پس از این که تک لایه کاملی از یاختهها پدیدار شد، 100TCID50 ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 بر روی کشت یاختهای برده شد. در خانه کنترل یاخته تنها محیط کشت و در خانه کنترل ویروس محیط کشت با ویروس و در خانه کنترل دارو محیط کشت با بالاترین غلظت غیرتوکسیک عصاره سرخارگل ریخته شد. سپس رقتهای گوناگونی از عصاره گیاهی سرخارگل (50، 100، 200، 300، 400، 500، 600، 700، 800 و 900 μg/ml) در زمانهای یک ساعت، دو ساعت و سه ساعت پس از بردن ویروس بر روی یاختهها به خانهها افزوده گردید. در پایان پلیت آماده شده در گرمخانه 0C37 گذاشته شد و تا یک هفته هر روز اثر ضدویروسی عصاره با روش Neutralization test (NT)به صورت بازدارندگی از CPE (Cytopathic effect) ویروس از دید میکروسکوپی بررسی گردید. این ویژگی به صورت آسیب ندیدن یاختهها بدون نشان دادن اثر سایتوپاتیک ویروس بر روی آنها دیده میشود. هرکدام از آزمایشها 3 بار بررسی شد.
یافته ها
دراین پژوهش عیار ویروسی %ml TCID50/ 105×3 برای ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 به دست آمد. در بررسی سیتوکسیسیته عصاره گیاهی سرخارگل دیده شد که در غلظتهای به کار رفته آن، تنها غلظت μg/ml1000 اثر کشندگی بر روی یاختههای Hep-2 داشت و در غلظتهای دیگر یاختهها بدون آسیب یاختهای بودند.
در آزمایش اثر ضدویروسی گیاه در زمانهای گوناگوناثردهی عصاره نشان داد که عصاره سرخارگل در زمان یک ساعت در غلظتهای غیرتوکسیک به کار رفته (50، 100، 200، 300، 400، 500، 600، 700، 800 و 900 μg/ml) بر روی دودمانهای یاختهای اثر ضدهرپسی خوبی بر روی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 دارد و میتواند در غلظتهای بیش از μg/ml 400 بازدارنده تکثیر کامل ویروس باشد (جدول 1)، ولی پیشگیری از تکثیر کامل ویروس در زمان دو ساعت تا رقتهای کمتر از
μg/ml 700 کاسته شده بود و آسیب یاختهای (CPE) در پلیت آزمایشی پدیدار گردیده بود. ویژگی ضدهرپسی عصاره آبی سرخارگلدر زمان سه ساعت تنها در چاهک دارای غلظت μg/ml 900 بدون CPE دیده میشد. (جدول 1). نمودار 1 نشاندهنده اثر ضدهرپسی صددرصد گیاه سرخارگل در رقتهای μg/ml 900-500 در زمان یک ساعتپس از بردن ویروس بر روی یاختهها است که در رقتهای پایینتر این ویژگی کاهش مییابد و در رقت μg/ml 50 از عصاره، ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 توانسته بود 85% یاختهها را آسیب زند.درحالی که عصاره گیاهی در دو ساعت در غلظتهای
μg/ml 900-700 (نمودار 2) و در سه ساعت در غلظت μg/ml 900 به طور کامل از تکثیر ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 پیشگیری میکند (نمودار 3). با گذشت زمان بیشتر برای اثردهی عصاره، CPE ویروس در غلظتهای پایینتر 94% تا 100% دیده میشود، به ویژه در سه ساعت در بیشتر چاهکها آسیب یاختهای 69% تا 100% است. یافتههای به دست آمده از این پژوهش نشانگر بیشترین کارایی گیاه سرخارگل در بازدارندگی از تکثیر ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 دریک ساعت پس از بردن ویروس بر روی یاختههای Hep-2 بود و هرچه زمان اثردهی عصاره سرخارگل بر روی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 بیشتر میشود، کارایی ضدویروسی عصاره در پیشگیری از تکثیر ویروس کمتر میشود و در چاهکهای بیشتری از کشت یاختهای، CPE ویروس به چشم میخورد. هم چنین در روز پایانی هفته آزمایش در زمانهای یک ساعت و دو ساعت اثردهی عصارهدیده شد که عصاره گیاهی بر روی یاخته Hep-2 نقش نگهدارندگی دارد که در سه ساعت این نقش عصاره کمتر شده بود.
جدول 1 : بررسی اثر بازدارندگی عصاره سرخارگل بر تکثیر هرپس سیمپلکس تیپ 1 در زمانهای گوناگون اثر دهی عصاره
زمان اثر دهی عصاره |
غلظت عصاره |
|||||||||
900 μg/ml |
800 μg/ml |
700 μg/ml |
600 μg/ml |
500 μg/ml |
400 μg/ml |
300 μg/ml |
200 μg/ml |
100 μg/ml |
50 μg/ml |
|
یک ساعت پس از تلقیح ویروس |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
دو ساعت پس از تلقیح ویروس |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
سه ساعت پس از تلقیح ویروس |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
: - دیده نشدن CPE ویروس
: + دیده شدن CPE ویروس
|
نمودار 1 : سنجش اثر ضدویروسی رقتهای گوناگون عصاره سرخارگل دریک ساعت پس از تلقیح ویروس
|
نمودار 2 : سنجش اثر ضدویروسی رقتهای گوناگون عصارهسرخارگل در دو ساعت پس از تلقیح ویروس
|
نمودار 3 : سنجش اثر ضدویروسی رقتهای گوناگون عصارهسرخارگل درسه ساعت پس از تلقیح ویروس
بحث
در این پژوهش گیاهسرخارگل در غلظتهای μg/ml 900-50 هیچ گونه اثر کشندگی بر روی یاختههای Hep-2 نداشت و تنها در بیشترین غلظت عصاره گیاهی μg/ml 1000 آسیب یاختهای دیده شد. گیاه اثر بازدارندگی کامل در غلظتهای بیش از μg/ml 400 بر روی تکثیر ویروس HSV-1 نشان داد. یافتههای به دست آمده نشانگر کارایی عصاره گیاهی در پیشگیری از تکثیر کامل ویروس در دامنه غلظتی μg/ml 900-700 در زمان دو ساعت پس از بردن ویروس بر روی یاختهها بود و این ویژگی در سه ساعت به کمترین اندازه خود رسیده بود تنها که چاهک دارای غلظت μg/ml 900 از عصاره آبی سرخارگل، بازدارنده تکثیر کامل ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 بود (جدول 1). به طوری که این یافتهها نشانگر کاهش کارایی گیاه با افزایش زمان اثردهی عصاره پس از تلقیح ویروس میباشد، چون آسیب یاختههای Hep-2 در اثر گسترش ویروس و CPE بالای آن افزایش یافته است و عصاره گیاهی نمیتواند بازدارنده تکثیر ویروس باشد. دلیل دیگر این پدیده میتواند درصد کم مواد ضدهرپسی در عصاره آبی ریشه سرخارگل باشد که با جداسازی آنها کارایی بیشتری بر بازدارندگی از تکثیر ویروس خواهد داشت. برپایه دادههای نموداری، گیاه هنگامی بیشترین ویژگی ضدویروسی را از خود نشان میدهد که یک ساعت پس از بردن ویروس بر کشت یاختهای به کار رود و درصد پیشگیری از اثر سایتوپاتیک ویروس با افزایش غلظت عصاره گیاهی افزایش مییابد. پژوهشهایی در زمینه ویژگی ضدویروسی سرخارگل شده است، ولی تاکنون این ویژگی در زمانهای گوناگون اثردهی عصارهبررسی نگردیده است، در پژوهش قائمی و همکارانش(29) در ایران عصاره آبی پیکر رویشی گیاه سرخارگل اثر ضدهرپسی خوبی برروی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 در کشت Veroنشان داد.در کارآزمایی دیگر ویژگی ضدویروسی عصاره ریشه گونههای اکیناسه پورپورا و اکیناسه پالیدا برروی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 و ویروس آنفلوآنزا روی کشت یاختهای Vero دیده شد و یافتههای آن نشانگر ضدویروس بودن ترکیب آلکامیدی گیاه سرخارگل بود.(30) در حالی که در پژوهش ما عصاره آبی گیاه روی یاختههای Hep-2که از انسان گرفته شده است، بررسی گردید و ویژگی بازدارندگی خوبی بر تکثیر ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 داشت. درکارآزماییدیگری ترکیب پلی ساکاریدی گیاه اکیناسه پورپورا برروی دوره نهفتگی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 بررسی گردید که با افزایش پاسخ ایمنی این دوره را کاهش میدهد.(31) هم چنین در پژوهش Schneider و همکارانش(32) عصاره هیدروالکلی و افشره اکیناسه پالیدا برروی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 و 2 اثر ضدهرپسینشان دادند و در کشت یاختههای کلیه میمون ساخت پلاک ویروسی را تا 99% یا 100 درصد کاهش دادند. یافتههای پژوهش عصارههای آبی و اتانولی چندین گونه سرخارگل بر روی ویروسهای سرماخوردگی مانند رینوویروسها، ویروسهای آنفلوآنزا A) و (B و هرپس سیمپلکس تیپ 1 نشان داد که کمترین غلظت بازدارنده تکثیر ویروس برای عصاره آبی گیاه برای ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1برابر μg/ml 4/1 بود(34و33) هم چنین از پدیدار شدن نشانههای تکثیر ویروسهای سرماخوردگی پیشگیری میکرد که این اثر ضدویروسی سرخارگل برای ترکیبهای کافئیک اسید و پلی ساکاریدهای آن میباشد.(38-35) در پژوهش ما کمترین غلظت بازدارنده تکثیر ویروس برابر μg/ml 50 بود و یافتههای به دست آمده گفتههای آنها را در زمینه ویژگی ضدهرپسی اکیناسه پورپورا تایید میکند. اثر ضدهرپسی سرخارگلمیتواند در بخش بالینی در سنجش با داروهای امروزی مانند آسیکلوویر بررسی شود تا با تایید ویژگی ضدویروسی بهتر این گیاه امیدی تازه برای درمان بیماریهای این ویروس که به درمان با داروهای امروزی مقاوم شده است، باشد. برای پیدا کردن سازوکار اثر این دارو بایستی پژوهشهای بیشتری شود تا در ساخت داروهای ضدهرپسی به کار رود
نتیجه گیری
گیاه سرخارگل ویژگی ضدویروسی خوبی بر روی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ 1 در کشت یاختهای Hep-2 دارد و درصد پیشگیری از تکثیر ویروس با افزایش غلظت عصاره گیاهی افزایش مییابد،.
تشکر و قدردانی
با سپاس فراوان از آقای دکتر همکار، آقای دکتر ضیایی و خانم دکتر طلعت مختاری آزاد، مدیر گروه بخش ویروسشناسیدانشکده بهداشت دانشگاه علوم پزشکی تهران کهدر این پژوهش، بسیار همکاری داشتند.