مقدمه

کارسینوم سلول سنگفرشی دهان (Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC)  شایع‌ترین بدخیمی حفره دهان بوده و حدود 90 درصد از کل سرطان‌های دهانی را تشکیل می‌دهد.⁽¹⁾ این بیماری یکی از مهم‌ترین معضلات سلامت عمومی در سراسر جهان محسوب می‌شود و سالانه صدها هزار مورد جدید در جهان گزارش می‌گردد.⁽²⁾ علی‌رغم پیشرفت‌های حاصل شده در روش‌های تشخیصی و درمانی، میزان بقای پنج‌ساله بیماران مبتلا به SCC-15 همچنان در حدود 50 تا 60 درصد باقی مانده است و پیش‌آگهی نامطلوب آن عمدتاً ناشی از تشخیص دیرهنگام، تهاجم موضعی، متاستاز و عود بیماری است.^{(4، 3)}

رده سلولی SCC-15 یک رده سلولی انسانی مشتق‌شده از کارسینوم سلول سنگفرشی زبان بوده و به‌طور گسترده به عنوان مدل آزمایشگاهی سرطان سلول سنگفرشی دهان مورد استفاده قرار می‌گیرد. این رده سلولی به دلیل حفظ بسیاری از ویژگی‌های مولکولی و زیستی تومور اولیه، از جمله ظرفیت تکثیر، پاسخ به عوامل ضدسرطان و تغییرات مسیرهای تنظیم‌کننده آپوپتوز، مدل مناسبی برای ارزیابی فعالیت ضدتوموری ترکیبات طبیعی و دارویی در شرایط آزمایشگاهی محسوب می‌شود. عوامل متعددی در بروز و پیشرفت SCC-15 نقش دارند که از مهم‌ترین آن‌ها می‌توان به مصرف دخانیات، الکل، عفونت با ویروس پاپیلومای انسانی (HPV)، عوامل محیطی، التهاب مزمن و استعدادهای ژنتیکی اشاره کرد.^{(6، 5)} این عوامل از طریق ایجاد آسیب DNA ، اختلال در مسیرهای تنظیم‌کننده چرخه سلولی و تغییر در بیان ژن‌های مرتبط با بقا و مرگ سلولی، در فرایند سرطان‌زایی دخالت می‌کنند.⁽⁷⁾

یکی از ویژگی‌های اساسی سلول‌های سرطانی، توانایی فرار از آپوپتوز یا مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی است. آپوپتوز نقش مهمی در حفظ هموستاز بافتی و حذف سلول‌های آسیب‌دیده یا دارای جهش ایفا می‌کند.⁽⁸⁾ اختلال در مسیرهای آپوپتوز موجب بقای سلول‌های غیرطبیعی، افزایش تکثیر سلولی و پیشرفت تومور می‌شود.⁽⁹⁾ از این رو، القای آپوپتوز به عنوان یکی از اهداف اصلی درمان‌های ضدسرطان شناخته می‌شود و بسیاری از داروهای ضدسرطان از طریق فعال‌سازی این مسیر اثر خود را اعمال می‌کنند.⁽¹⁰⁾

در میان عوامل مولکولی دخیل در سرطان دهان، ژن TP53 از مهم‌ترین ژن‌های سرکوبگر تومور محسوب می‌شود. پروتئین p53 که به عنوان «نگهبان ژنوم» شناخته می‌شود، در پاسخ به آسیب DNA، استرس اکسیداتیو و سایر تنش‌های سلولی فعال شده و از طریق توقف چرخه سلولی، ترمیم DNA، پیری سلولی و القای آپوپتوز از تکثیر سلول‌های آسیب‌دیده جلوگیری می‌کند.^(11،12) جهش یا غیرفعال شدن TP53 یکی از شایع‌ترین تغییرات ژنتیکی در SCC-15 بوده و در بیش از نیمی از موارد گزارش شده است.⁽¹³⁾ اختلال در عملکرد p53 با افزایش تهاجم تومور، مقاومت به درمان و پیش‌آگهی ضعیف‌تر همراه است.⁽¹⁴⁾

در سال‌های اخیر، استفاده از ترکیبات طبیعی و فرآورده‌های گیاهی به عنوان منابع بالقوه داروهای ضدسرطان مورد توجه گسترده قرار گرفته است. گیاه سیاه‌دانه (Nigella sativa) از خانواده Ranunculaceae یکی از گیاهان دارویی شناخته‌شده در طب سنتی خاورمیانه، آسیا و آفریقا است که به دلیل خواص ضدالتهابی، آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضدتوموری مورد مطالعه قرار گرفته است.^(15،16) ترکیبات زیست‌فعال متعددی از جمله تیموکینون (Thymoquinone)،  تیموهیدروکینون، تیمول، آلکالوئیدها و فلاونوئیدها در این گیاه شناسایی شده‌اند که در ایجاد اثرات فارماکولوژیک آن نقش دارند.⁽¹⁷⁾

تیموکینون، مهم‌ترین ترکیب فعال سیاه‌دانه، در مطالعات متعدد آزمایشگاهی و حیوانی اثرات ضدسرطانی قابل توجهی نشان داده است. گزارش شده است که این ترکیب می‌تواند از طریق مهار تکثیر سلولی، توقف چرخه سلولی و القای آپوپتوز بر رشد تومور اثر بگذارد.^(20–18) مطالعات نشان داده‌اند که تیموکینون می‌تواند با هدف قرار دادن مسیر PI3K/AKT ، موجب مهار ترجمه cyclin D1، توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و القای آپوپتوز در سلول‌های سرطانی شود.⁽²¹⁾ همچنین شواهد نشان می‌دهد که تیموکینون قادر است مسیرهای مولکولی متعددی از جمله NF-κB ، PI3K/AKT ، MAPK  و p53 را تنظیم کند.^(21،22) برخی مطالعات افزایش بیان p53 و فعال‌سازی کاسپازها را در سلول‌های سرطانی تیمار شده با تیموکینون گزارش کرده‌اند که نشان‌دهنده نقش احتمالی این ترکیب در القای آپوپتوز وابسته به  p53 است.^(23-25)

با وجود شواهد روبه رشد درباره اثرات ضدسرطانی Nigella sativa و تیموکینون در انواع مختلف سرطان‌ها از جمله سرطان پستان، کولون، پروستات و ریه، مطالعات انجام شده بر روی کارسینوم سلول سنگفرشی دهان همچنان محدود است و نتایج موجود نیز به دلیل تفاوت در نوع عصاره، غلظت مورد استفاده، مدت زمان تیمار و مدل‌های سلولی مورد بررسی، یکسان نیستند.^(28–26) افزون بر این، اطلاعات اندکی درباره تأثیر عصاره هیدروالکلی سیاه‌دانه بر بیان ژن p53 در سلول‌های SCC-15 و میزان انتخاب‌پذیری آن در برابر سلول‌های طبیعی دهانی وجود دارد. بنابراین، با توجه به اهمیت یافتن عوامل درمانی جدید با سمیت کمتر و کارایی بیشتر علیه سرطان دهان، مطالعه

حاضر با هدف بررسی اثرات سیتوتوکسیک و القاکننده آپوپتوز عصاره هیدروالکلی  Nigella sativa  بر سلول‌های کارسینوم سلول سنگفرشی دهان SCC-15 و فیبروبلاست‌های طبیعی لثه انسان و همچنین ارزیابی ارتباط این اثرات با تغییرات بیان ژن TP53 در شرایط آزمایشگاهی طراحی و اجرا شد. نتایج این پژوهش می‌تواند در درک بهتر مکانیسم‌های ضدسرطانی سیاه‌دانه و ارزیابی ظرفیت بالقوه آن به عنوان یک عامل کمکی در درمان سرطان دهان مؤثر باشد.

 مواد و روش‌ها ‌

تهیه گیاه و استخراج عصاره هیدروالکلی

بذرهای سیاهدانه (Nigella sativa) از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران (IBRC) تهیه شدند. هویت گونه گیاهی بر اساس اطلاعات ثبت شده و مشخصات ارائه شده توسط این مرکز تایید گردید. مقدار 50 گرم از بذرهای خشک پس از آسیاب شدن، در اتانول 80 درصد سوسپانسیون شده و به مدت 72 ساعت بر روی شیکر آزمایشگاهی در دمای اتاق قرار گرفت. ^(30-28) پس از پایان فرایند استخراج، مخلوط حاصل از کاغذ صافی واتمن شماره 1 عبور داده شد. حلال با استفاده از دستگاه روتاری اواپراتور RV 10 rotary evaporator (IKA, Staufen, Germany) تحت فشار کاهش‌یافته حذف گردید. سپس عصاره با استفاده از آون U6320 (فاطر الکتریک، ایران) خشک و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.  بازده استخراج عصاره خشک هیدروالکلی سیاهدانه بر اساس وزن اولیه نمونه، ۱۲٪ محاسبه شد. برای آزمایش‌های سلولی، عصاره در DMSO حل شد و غلظت‌های 5، 10، 25، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر تهیه گردید. غلظت نهایی DMSO در تمامی گروه‌ها کمتر از 1/0 درصد حفظ شد.

کشت سلولی

سلول‌های کارسینوم سلول سنگفرشی دهان SCC-15  (IBRC 10870) و فیبروبلاست طبیعی لثه انسان HuGu (IBRC 10459) از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شدند. سلول‌ها در محیط DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد محلول پنی‌سیلین-استرپتومایسین کشت داده شدند و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، رطوبت اشباع و 5 درصد CO₂ نگهداری شدند.⁽²¹⁾ گروه کنترل منفی شامل سلول‌های تیمارشده با همان غلظت DMSO و بدون عصاره بود. غلظت های 5، 10، 25، 50 و 100 µg.ml از گیاه تهیه گردیدند.

آزمون MTT

برای ارزیابی زنده‌مانی سلولی از آزمون MTT استفاده شد. آزمون MTT بر اساس توانایی سلول‌های زنده در احیای نمک تترازولیوم MTT به کریستال‌های فورمازان توسط آنزیم‌های میتوکندریایی انجام می‌شود. میزان فورمازان تولیدشده متناسب با تعداد سلول‌های زنده و فعال از نظر متابولیکی بوده است. سلول‌های SCC-15 و HuGu با تراکم 10³×5 سلول در هر چاهک در پلیت 96 خانه کشت داده شدند. پس از تیمار با غلظت‌های مختلف عصاره سیاهدانه به مدت 24، 48 و 72 ساعت، محلول MTT به هر چاهک افزوده شد و نمونه‌ها به مدت 4 ساعت انکوبه شدند. کریستال‌های فورمازان تشکیل‌شده با DMSO حل شدند و جذب نوری در طول موج 570 نانومتر توسط دستگاه ELx800TS microplate reader (BioTek, USA)اندازه‌گیری شد. میزان محاسبه شده شاخصی از درصد زنده‌مانی سلولی محسوب می‌شود. بنابراین، کاهش جذب نوری پس از تیمار نشان‌دهنده کاهش فعالیت متابولیکی و کاهش زنده‌مانی سلول‌ها است. غلظت نهایی DMSO در تمامی تیمارها کمتر از 1/0% بود و گروه کنترل حلال (Vehicle Control)  نیز در تمامی آزمایش‌ها در نظر گرفته شد. درصد زنده‌مانی سلولی نسبت به گروه کنترل محاسبه گردید. مقادیر IC50 با استفاده از پردازش منحنی دوز-پاسخ غیرخطی(nonlinear regression)  با مدل log(inhibitor) versus normalized response به همراه بازه اطمینان 95% و با استفاده از نرم‌افزار GraphPad Prism نسخه 10 محاسبه شد.^(32،33)

بررسی آپوپتوز با فلوسایتومتری

برای ارزیابی آپوپتوز از کیت Annexin V Apoptosis Detection Kit )FITC( استفاده شد. پس از تیمار، سلول‌ها (تعداد 10⁵) جمع‌آوری و با PBS شستشو داده شدند. سپس با رنگ‌های Annexin V-FITC و Propidium Iodide رنگ‌آمیزی شدند. حداقل 10000 رویداد برای هر نمونه توسط دستگاه فلوسایتومتر BriCyte E6 (Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd., Shenzhen, China)  ثبت و تحلیل شد.⁽³⁴⁾ درصد سلول‌های زنده، آپوپتوتیک اولیه، آپوپتوتیک دیررس و نکروتیک تعیین گردید.

استخراج RNA و سنتز cDNA

RNA با استفاده از RNA Extraction Kit (Sinaclon Co., Tehran, Iran) استخراج شد. غلظت و خلوص RNA با دستگاه NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific, USA)اندازه‌گیری گردید.⁽³⁵⁾ سپس سنتز cDNA با استفاده از Cdna Synthesis Kit (Sinaclon Co., Tehran, Iran) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد.

بررسی بیان ژن TP53 با Real-Time PCR

بیان ژن TP53 با استفاده از روش Real-Time PCR مبتنی بر SYBR Green ارزیابی شد. ژن GAPDH به عنوان ژن مرجع(Housekeeping Gene)  انتخاب گردید. توالی پرایمرهای مورد استفاده ارائه شده است (جدول 1).

واکنش PCR در حجم نهایی 20 میکرولیتر شامل 10 میکرولیتر RealQ Plus 2× Master Mix Green (Yekta Tajhiz Azma, Iran)، یک میکرولیتر از هر پرایمر، دو میکرولیتر cDNA و آب بدون نوکلئاز انجام شد. واکنش‌ها در دستگاه CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) انجام گرفت.

برنامه حرارتی شامل دناتوره شدن اولیه در 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه و سپس 40 چرخه شامل 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 ثانیه و 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه بود. میزان بیان نسبی ژن با استفاده از روش 2^-ΔΔCt محاسبه گردید.^(36،37)

تمامی آزمایش‌ها در سه تکرار مستقل زیستی انجام شدند و هر نمونه در هر آزمایش به صورت تریپلیکیت فنی اندازه گیری شدند(3n=). داده‌ها به صورت انحراف معیار ± میانگین گزارش شدند. داده‌های به‌دست‌آمده از آزمون‌های MTT، Real-Time PCR و فلوسایتومتری به صورت انحراف معیار ± میانگین (Mean ± SD) گزارش شدند. برای

بررسی توزیع نرمال داده‌ها از آزمون Shapiro–Wilk استفاده شد. مقایسه بین گروه‌ها با توجه به نوع داده‌ها با آزمون‌های آماری مناسب انجام شد. تحلیل آماری با استفاده از نرم‌افزار IBM SPSS Statistics نسخه 29 انجام شد. برای مقایسه گروه‌ها از آزمون t مستقل استفاده شد. سطح معنی‌داری 05/0 در نظر گرفته شد.

یافته‌ها

تأثیر عصاره هیدروالکلی سیاهدانه بر زنده‌مانی سلولی

نتایج آزمون MTT نشان داد که عصاره هیدروالکلی سیاهدانه موجب کاهش معنی‌دار زنده‌مانی سلول‌های SCC-15 به صورت وابسته به دوز و زمان شد. همان‌گونه که در جدول 2 نشان داده شده است، با افزایش غلظت عصاره، درصد بقای سلول‌های SCC-15 در تمامی زمان‌های مورد بررسی کاهش یافت. (شکل 1)

پس از 72 ساعت تیمار، زنده‌مانی سلول‌های SCC-15 در غلظت 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر به 4/11 درصد کاهش یافت. در مقابل، زنده‌مانی سلول‌های HuGu در همان غلظت بیش از 62 درصد باقی ماند که بیانگر حساسیت بیشتر سلول‌های سرطانی نسبت به سلول‌های طبیعی بود. (شکل2)

در زمان 72 ساعت، اثر سیتوتوکسیک عصاره هیدروالکلی سیاهدانه به حداکثر میزان خود رسید. در این زمان، زنده‌مانی سلول‌های 15SCC- در غلظت 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر به حدود 11 درصد کاهش یافت، در حالی که بیش از 60 درصد سلول‌های HUGU همچنان زنده باقی ماندند.

میلی‌لیتر به حدود 11 درصد کاهش یافت، در حالی که بیش همچنین کاهش مقدار IC50 از 9/110 میکروگرم بر میلی‌لیتر در 24 ساعت به 42/36 میکروگرم بر میلی‌لیتر در 72 ساعت نشان‌دهنده وابستگی اثر عصاره به زمان است. افزایش شاخص انتخاب‌پذیری ( 23/7 (SI= در 72 ساعت نیز بیانگر آن است که با افزایش مدت تیمار، عصاره به‌طور انتخابی اثر مهاری بیشتری بر سلول‌های سرطانی نسبت به سلول‌های طبیعی اعمال کرده است.

مقادیر IC50 برای سلول‌های SCC-15 در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت به ترتیب 9/110، 49/62و 42/36 میکروگرم بر میلی‌لیتر محاسبه شد. در سلول‌های HuGu این مقادیر به ترتیب 1/290، 3/180 و 3/263 میکروگرم بر میلی‌لیتر به دست آمد. شاخص انتخاب‌پذیری (SI) در طول زمان افزایش یافت و در 72 ساعت به 23/7 رسید (جدول 3). در پایان، آنالیز منحنی ذوب(Melting Curve Analysis) جهت تأیید اختصاصیت محصولات تکثیر انجام شد (شکل3). 

تأثیر عصاره سیاهدانه بر بیان ژن TP53

نتایج Real-Time PCR نشان داد که تیمار سلول‌های SCC-15 با غلظت IC50 عصاره سیاهدانه به مدت 72 ساعت موجب افزایش معنی‌دار بیان ژن TP53 شد. میزان بیان نسبی این ژن در سلول‌های SCC-15 تیمارشده 8/24 برابر بیشتر از گروه کنترل بود (01/0P=).

در مقابل، در سلول‌های HuGu کاهش بیان ژن TP53 مشاهده شد و میزان Fold Change برابر با 21 گزارش گردید (003/0P=). مقایسه نتایج بین دو رده سلولی تفاوت معنی‌داری در الگوی بیان ژن TP53 پس از تیمار با عصاره سیاهدانه نشان داد (جداول 4 و 5).

بررسی آپوپتوز با فلوسایتومتری

نتایج فلوسایتومتری نشان داد که تیمار با عصاره سیاه دانه موجب افزایش هر دو جمعیت آپوپتوز اولیه (Early Apoptosis) و آپوپتوز دیررس (Late Apoptosis) در سلول های 15-SCC شد، در حالی که تغییرات در سلول های HuGu محدود تر بود (جدول 5) وتیمار سلول‌های SCC-15 با عصاره سیاهدانه موجب افزایش جمعیت سلول‌های آپوپتوتیک شد. درصد آپوپتوز اولیه از 54/2 درصد در گروه کنترل به 54/4 درصد در گروه تیمار افزایش یافت (027/0P=). همچنین درصد آپوپتوز دیررس از 06/4 درصد به 20/7 درصد رسید (89/0P=).

درصد سلول‌های زنده از 1/93 درصد در گروه کنترل به 9/87 درصد در گروه تیمار کاهش یافت، در حالی که درصد سلول‌های نکروتیک در هر دو گروه کمتر از یک درصد باقی ماند. در سلول‌های HuGu تغییرات محدودی در جمعیت سلول‌های آپوپتوتیک مشاهده شد (جدول 5 و شکل 4).

به طور کلی، عصاره هیدروالکلی سیاهدانه موجب کاهش وابسته به دوز و زمان زنده‌مانی سلول‌های SCC-15 شد. این اثر با افزایش بیان ژن TP53 و افزایش جمعیت سلول‌های آپوپتوتیک همراه بود، در حالی که اثرات مشاهده‌شده در سلول‌های طبیعی HuGu محدودتر بود.

بحث

در مطالعه حاضر، اثرات عصاره هیدروالکلی بذر سیاهدانه بر سلول‌های کارسینوم سلول سنگفرشی دهان (SCC-15) بررسی شد و تأثیر آن بر زنده‌مانی سلولی، آپوپتوز و بیان ژن TP53 مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که عصاره سیاهدانه موجب کاهش وابسته به دوز و زمان زنده‌مانی سلول‌های SCC-15 شد، در حالی که اثرات مشاهده‌شده در فیبروبلاست‌های طبیعی لثه انسان (HuGu) محدودتر بود. این یافته‌ها بیانگر حساسیت بیشتر سلول‌های سرطانی نسبت به تیمار با عصاره سیاهدانه در شرایط آزمایشگاهی است.

یافته‌های مطالعه حاضر نشان داد که عصاره هیدروالکلی سیاهدانه موجب کاهش وابسته به غلظت و زمان در زنده‌مانی سلول‌های SCC-15 شد، در حالی که اثر آن بر سلول‌های طبیعی HuGu88 محدودتر بود. این یافته می‌تواند نشان‌دهنده حساسیت نسبی بیشتر سلول‌های بدخیم به ترکیبات زیست‌فعال سیاهدانه باشد. همچنین، مقادیر بالاتر IC50 در سلول‌های HuGu و افزایش شاخص انتخاب‌پذیری در طول زمان حاکی از تفاوت پاسخ میان سلول‌های سرطانی و طبیعی بود. چنین تفاوتی از دیدگاه پژوهشی حائز اهمیت است، زیرا نشان می‌دهد ترکیبات موجود در سیاهدانه ممکن است بر سلول‌های بدخیم اثر بیشتری نسبت به سلول‌های طبیعی داشته باشند.^(18،19) در همین راستا، مطالعات جدید نشان داده‌اند که ترکیبات فعال موجود در Nigella sativa، به‌ویژه تیموکینون، قادر به مهار تکثیر و کاهش زنده‌مانی سلول‌های سرطانی از طریق القای آپوپتوز و تعدیل مسیرهای مرتبط با بقا هستند. همچنین، در یک مطالعه ، تیموکینون در سلول‌های کارسینوم سلول سنگفرشی دهان موجب کاهش وابسته به دوز زنده‌مانی سلولی و افزایش مرگ آپوپتوتیک شد. ^(20،21) این یافته‌ها با نتایج مطالعه حاضر در خصوص اثر مهاری عصاره سیاهدانه بر سلول‌های 15- SCCهمخوانی دارد.

یافته‌های مطالعه حاضر نشان داد که عصاره هیدروالکلی سیاهدانه موجب کاهش وابسته به غلظت و زمان در زنده‌مانی سلول‌های  15- SCC  شد، در حالی که اثر آن بر سلول‌های طبیعی HuGu به مراتب کمتر بود. این نتایج نشان‌دهنده انتخاب‌پذیری نسبی عصاره در برابر سلول‌های سرطانی است. مطالعات اخیر نیز نشان داده‌اند که تیموکینون، به عنوان مهم‌ترین ترکیب فعال سیاهدانه، با مهار تکثیر سلولی، توقف چرخه سلولی و القای آپوپتوز، موجب کاهش رشد سلول‌های سرطان سلول سنگفرشی سر و گردن می‌شود. علاوه بر این، گزارش شده است که تیموکینون با افزایش بیان پروتئین‌های پیش‌برنده آپوپتوز نظیر p53، Bax و کاسپازها و کاهش بیان پروتئین‌های ضدآپوپتوز مانند Bcl-2، اثرات ضدسرطانی خود را اعمال می‌کند که با یافته‌های مطالعه حاضر همخوانی دارد.^{(43 ،42)}

مطالعات پیشین نشان داده‌اند که ترکیبات زیست‌فعال موجود در سیاهدانه، به‌ویژه تیموکینون، دارای اثرات ضدتکثیری و القاکننده آپوپتوز در انواع مختلف سلول‌های سرطانی هستند. تیموکینون با اثرگذاری بر چندین مسیر پیام‌رسانی سلولی مرتبط با تکثیر، بقا و مرگ سلولی، می‌تواند رشد و پیشرفت سلول‌های سرطانی را مهار کند.^(38-40) مطالعات اخیر نشان می‌دهند که اثرات ضدسرطانی تیموکینون محدود به مهار تکثیر سلولی نبوده و مجموعه‌ای از مسیرهای مولکولی مرتبط با آپوپتوز، استرس اکسیداتیو و بقای سلولی را تحت تأثیر قرار می‌دهد.⁽⁴¹⁾ در یک مرور نظام‌مند در زمینه سرطان‌های سلول سنگفرشی سر و گردن، افزایش فعالیت مسیرهای پیش‌برنده آپوپتوز شامل p53، Bax و کاسپازها و همچنین کاهش فعالیت مسیرهای ضدآپوپتوزی مانند Bcl-2 و MDM2 به‌عنوان یکی از مکانیسم‌های مهم اثر تیموکینون مطرح شده است.^(41،42) علاوه بر این، شواهد جدید در سلول‌های سرطان دهان نشان داده‌اند که تیموکینون می‌تواند از طریق افزایش استرس اکسیداتیو و تعدیل بیان پروتئین‌های مرتبط با بقا وآپوپتوز سلولی، اثر ضدتکثیری و پروآپوپتوتیک ایجاد کند.^(38،42) بنابراین، نتایج مطالعه حاضر را می‌توان در چارچوب مجموعه‌ای از اثرات مولکولی تیموکینون و سایر ترکیبات زیست‌فعال موجود در سیاهدانه تفسیر کرد.^(22،23)

نتایج Real-Time PCR افزایش معنی‌دار بیان ژن TP53 را در سلول‌های 15-SCC تیمارشده نشان داد. نتایج Real-Time PCR مطالعه حاضر نشان‌دهنده افزایش معنی‌دار بیان mRNA ژن TP53 در سلول‌های  15- SCC  پس از تیمار با عصاره سیاهدانه بود. از آنجا که p53 یکی از تنظیم‌کننده‌های مهم پاسخ سلولی به آسیب DNA، توقف چرخه سلولی و آپوپتوز است، افزایش بیان TP53 می‌تواند با فعال شدن پاسخ‌های ضدتکثیری و پروآپوپتوتیک در سلول‌های تیمارشده ارتباط داشته باشد. شواهد حاصل از مطالعات جدید در سرطان‌های سلول سنگفرشی سر و گردن نیز نشان داده‌اند که مسیر p53 در پاسخ به تیموکینون نقش مهمی در القای اثرات ضدسرطانی دارد. با این حال، باید توجه داشت که افزایش mRNA ژن TP53 به‌تنهایی اثبات‌کننده افزایش فعالیت عملکردی پروتئین p53 نیست. از این رو، با توجه به اینکه در مطالعه حاضر وضعیت جهش TP53، سطح پروتئین p53 و فعالیت عملکردی آن بررسی نشده است، یافته حاضر باید با احتیاط تفسیر شود. انجام مطالعات تکمیلی در سطح پروتئین و بررسی اهداف پایین‌دستی مسیر p53 می‌تواند به روشن شدن نقش عملکردی این مسیر در اثر عصاره سیاهدانه کمک
کند.^(23-20)

نتایج فلوسایتومتری مطالعه حاضر افزایش معنی‌دار جمعیت سلول‌های آپوپتوتیک را پس از تیمار با عصاره سیاهدانه نشان داد، در حالی که تغییرات ایجادشده در سلول‌های طبیعی محدودتر بود. افزایش آپوپتوز همراه با کاهش زنده‌مانی سلولی، یافته‌های حاصل از آزمون سمیت سلولی را تقویت می‌کند و نشان می‌دهد که کاهش تعداد سلول‌های زنده احتمالاً تا حدی ناشی از فعال شدن مسیرهای مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی است. این یافته با شواهد اخیر در مورد تیموکینون در سرطان‌های سلول سنگفرشی سر و گردن همخوانی دارد؛ به‌طوری‌که در مطالعات پیشین افزایش نشانگرهای پیش‌آپوپتوتیک و فعال شدن کاسپازها پس از مواجهه با تیموکینون گزارش شده است. همچنین، مطالعه‌ای  در سلول‌های کارسینوم سلول سنگفرشی دهان نشان داد که تیموکینون می‌تواند از طریق تغییر تعادل عوامل مرتبط با آپوپتوز و افزایش استرس اکسیداتیو، مرگ سلولی را تقویت کند.^(20،21)

نتایج نشان داد که تیمار با عصاره سیاهدانه موجب افزایش معنی‌دار آپوپتوز اولیه و دیررس در سلول‌های 15SCC- شد، در حالی که تغییرات ایجاد شده در سلول‌های طبیعی محدودتر بود. این یافته مؤید اثر انتخابی عصاره بر سلول‌های بدخیم است و با مطالعات اخیر که افزایش آپوپتوز و کاهش بقای سلول‌های سرطان دهان را پس از مواجهه با تیموکینون گزارش کرده‌اند، همخوانی دارد.^(42،44)

با وجود نتایج امیدوارکننده، مطالعه حاضر دارای محدودیت‌هایی  است.  نخست، آزمایش‌ها  در  شرایط    in vitro و بر روی یک رده سلولی سرطان دهان، یعنی SCC-15، انجام شد و بنابراین تعمیم نتایج به سایر انواع سرطان دهان یا شرایط in vivo باید با احتیاط صورت گیرد. دوم، اگرچه افزایش بیان TP53 و افزایش آپوپتوز مشاهده شد، در این مطالعه سطح پروتئین p53 و سایر اجزای مسیرهای پایین‌دستی آپوپتوز بررسی نشد. همچنین، با توجه به اینکه عصاره مورد استفاده حاوی مجموعه‌ای از ترکیبات زیست‌فعال است، نمی‌توان اثر مشاهده‌شده را به‌طور قطعی به تیموکینون نسبت داد. مطالعات اخیر نشان داده‌اند که علاوه بر تیموکینون، ترکیبات دیگری از Nigella sativa مانند α-hederin نیز ممکن است در اثرات ضدسرطانی عصاره نقش داشته باشند. بنابراین، شناسایی و تعیین مقدار ترکیبات فعال عصاره و مقایسه اثر عصاره کامل با ترکیبات خالص می‌تواند در مطالعات آینده اهمیت داشته باشد. در نهایت، انجام مطالعات in vivo، بررسی رده‌های سلولی مختلف و ارزیابی نشانگرهای پروتئینی و مسیرهای پیام‌رسانی مرتبط با آپوپتوز برای تأیید مکانیسم اثر و بررسی قابلیت ترجمه این یافته‌ها با مطالعات پیش‌بالینی و بالینی ضروری است.^(23،24)

در مجموع، یافته‌های این مطالعه نشان داد که عصاره هیدروالکلی سیاهدانه در شرایط آزمایشگاهی دارای اثرات مهارکننده رشد و القاکننده آپوپتوز در سلول‌های SCC-15 است و با افزایش بیان mRNA ژن   TP53 همراه می‌باشد. این نتایج می‌تواند مبنایی برای انجام مطالعات تکمیلی درباره ظرفیت زیستی ترکیبات موجود در سیاهدانه در تحقیقات سرطان دهان باشد.

نتیجه‌گیری

یافته‌های این مطالعه نشان داد که عصاره هیدروالکلی دانه Nigella sativa در شرایط آزمایشگاهی موجب کاهش معنی‌دار زنده‌مانی سلول‌های کارسینوم سلول سنگفرشی دهان (SCC-15) به‌صورت وابسته به دوز و زمان شد. همچنین، این عصاره در مقایسه با فیبروبلاست‌های طبیعی لثه انسان اثرات سیتوتوکسیک کمتری نشان داد که بیانگر حساسیت بیشتر سلول‌های سرطانی به تیمار با عصاره مورد بررسی است.

نتایج حاصل از آنالیز بیان ژن و فلوسایتومتری نشان داد که کاهش زنده‌مانی سلولی با افزایش بیان mRNA ژنTP53  و افزایش جمعیت سلول‌های آپوپتوتیک همراه بوده است. این یافته‌ها نشان می‌دهد که القای آپوپتوز ممکن است یکی از مکانیسم‌های دخیل در اثرات زیستی مشاهده‌شده باشد.

با توجه به اینکه در این پژوهش از عصاره کامل گیاه استفاده شد، احتمال می‌رود مجموعه‌ای از ترکیبات زیست‌فعال موجود در سیاهدانه در ایجاد پاسخ‌های مشاهده‌شده نقش داشته باشند. با این حال، تعیین سهم هر یک از ترکیبات فعال و شناسایی دقیق مکانیسم‌های مولکولی نیازمند مطالعات تکمیلی است. با توجه به انتخاب‌پذیری مناسب عصاره سیاه دانه در مهار سلول‌های  15- SCC و القای آپوپتوز، این ترکیب می‌تواند به عنوان یک گزینه امیدوارکننده برای مطالعات پیش‌بالینی و توسعه درمان‌های کمکی سرطان دهان مورد توجه قرار گیرد.

در مجموع، نتایج این پژوهش شواهدی در حمایت از ظرفیت زیستی عصاره هیدروالکلی سیاه دانه در مهار رشد سلول‌های SCC-15 در شرایط آزمایشگاهی فراهم می‌کند. با این وجود، برای ارزیابی اهمیت زیستی و کاربرد بالقوه این یافته‌ها، انجام مطالعات مکانیسمی بیشتر، بررسی در مدل‌های حیوانی و در نهایت مطالعات بالینی ضروری است.

تشکر و قدردانی

این مقاله برگرفته از پایان‌نامه طرح پژوهشی انجام‌شده در دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران و مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران می‌باشد. نویسندگان مراتب سپاس و قدردانی خود را از مسئولان، اعضای هیئت علمی دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی آزاد تهران و کارکنان آزمایشگاه‌های مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران که در انجام این پژوهش همکاری و حمایت لازم را فراهم نمودند، ابراز می‌دارند.

تضاد منافع

نویسندگان اعلام می‌کنند که هیچ‌گونه تعارض منافعی در ارتباط با این پژوهش وجود ندارد.