نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد مهندسی مواد، دانشکده مهندسی مواد و متالورژی، دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
2 دانشیار گروه مهندسی مواد، دانشکده مهندسی مواد و متالورژی، دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
3 دکتری مهندسی مواد، دانشکده مهندسی مواد و متالورژی، دانشگاه سمنان، سمنان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Bone injuries are among the challenges of medical science that each year has high costs for treatment in the world. Fluorhydroxyapatite plays an important role in promoting the integration of bones and dental implants, increasing bone density and calcium levels, and accelerating the recovery of bone fractures.
Materials and Methods: In this study, fluorhydroxyapatite powder and composite scaffolds with different weight percentages (40, 50, and 60) of fluorhydroxyapatite were fabricated through co-precipitation and freeze drying mechanisms, respectively. In order to investigate the microscopic properties of composite scaffolds, scanning electron microscopy was used. Also, X-ray diffraction (XRD) and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy tests were used to evaluate the purity of the manufactured specimens. In addition, in order to evaluate the biological properties of composite scaffolds, MTT and alkaline phosphatase (ALP) tests were used, and finally, the strength of scaffolds and the rate of water absorption were studied. Data analysis was performed using one-way analysis of variance.
Results: Microscopic investigations indicated a porous microstructure with pore diameters within the range of 100-350 μm, which is acceptable for osteoblastic cells to grow and proliferate. Also, the results of FTIR and XRD confirmed the absence of impurities in the samples. In addition, the non-toxicity of the produced specimens and the proper functioning of the bone cells were confirmed through MTT assay (after 3 and 7 days) and ALP activity (after 3, 7, and 14 days), respectively. Accordingly, the scaffold with 60 wt% of fluorhydroxyapatite showed more biocompatibility and ALP activity than the other two scaffolds. Also, the average of Young's modulus and yield strength for the samples were 40 and 7 MPa, which are acceptable for use in bone tissue engineering.
Conclusion: The results showed that the application of fluorhydroxyapatite with gelatin not only improves biological properties but also improves the mechanical properties of the scaffold. Additionally, the obtained results emphasized the potential use of prepared scaffolds to repair bone tissue.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
مهندسی بافت، علمی میان رشته ای است که با بکارگیری قوانین مهندسی و علوم بیولوژی، رویکردی نوین جهت ترمیم بافت های طبیعی بدن، ارائه می دهد.(2و1) در مهندسی بافت، وجود داربست زیست تقلیدی مناسب، برای بقای سلول ها ضروری است. داربست ها باید ریزمحیط طبیعی اطراف سلول ها را محیا کنند و از چسبندگی سلولی، لنگراندازی، تکثیر و مهاجرت سلول ها حمایت به عمل آورند. مدول الاستیک فلزات بالاتر از GPa100 می باشد که به مراتب بالاتر از میزان سفتی استخوان متراکم خواهد بود. نتیجه این سفتی بالا، بروز پدیده حفاظت تنشی روی استخوان در حال رشد است که منجر به نازکی بافت جدید استخوانی خواهد شد و احتمال شکست مجدد آن را افزایش خواهد داد.(3) مشکلاتی از این قبیل، توجه بسیاری از پژوهشگران را به سوی مواد جدیدتری معطوف نمود. بدین ترتیب باب جدید موسوم به مهندسی بافت استخوان بازشد و بیومتریال های نوینی برای این منظور به جامعه پزشکی معرفی گردید. به طور کلی مهندسی بافت را می توان تحت عنوان کاربرد اصول علمی جهت طراحی، ساخت، اصلاح، رشد و ابقاء بافت های زنده بدن تعریف نمود که به موجب آن خواص یک بیومتریال به گونه ای دستخوش تغییرات قرار می گیرد که قادر به تشکیل بافت یا رهایش تودهای از سلول ها به داخل بدن میزبان باشد و نهایتا منجر به تشکیل بافت جدید گردد.(6-4) بنابراین میتوان گفت که روش مهندسی بافت استخوان بر اساس بکارگیری بیومتریال هایتخریب پذیر استوار است و علیرغم تنوعی که دارد، غالبا ازیک قاعده کّلی تبعیت میکند که مراحل آن ساخت یک داربست یا حامل تخریب پذیر، بارگذاریسلول ها، داروها، پروتئین های رشد و بطور عموم عواملبرانگیزنده رشد استخوان و در نهایت کاشت موثر مجموعه در موضع مورد نظر را شامل میشود.(7)
داربست متخلخل در درون بدن شروع به تخریب شدن می نماید و همزمان با آن، سلول های کشت شده در داخل سازه به رشد و تکثیر خود ادامه می دهند تا اینکه نهایتا بافت استخوانی جدید جایگزین آن می شود. به چنین مجموعه هایی مجموعه سلولی اطلاق می گردد. البته علاوه بر این مجموعه ها، از مجموعه های غیر سلولی نیز در مهندسی بافت استخوان استفاده شده است ولی بکارگیریمجموعه های سلولی عملا نتایج مناسب تری را به بار می آورد.(8) در مجموعه های غیر سلولی خاصیت استخوان سازی توسط خود ماده ایمپلنت القاء میگردد لذا بیومتریال بکار رفته یا باید از قابلیت تحریک استخوان سازی بالایی برخوردار باشد و یا اینکه حاوی مواد برانگیزنده استخوان سازی همچون فاکتورهای رشد و پروتئین های زمینه خارج سلولی باشد تا موجب تشکیل استخوان در موضع گردد. (9)
به طور کلی سه گروه پلیمرها، سرامیک ها و کامپوزیت ها نامزدهای ماده داربستی هستند. پلیمرهای طبیعی که در این زمینه بکار می روند، عبارتند از کلاژن یا شکل تغییر یافته آن (ژلاتین)، زمینه استخوان مینرال زدایی شده و مشتقات کیتین.(10و5) در میان پلیمرهای مصنوعی نیز پلی لاکتیک اسید، پلی گلایکولیک اسید و کوپلیمرهای آنها از بیشترین کاربرد در مهندسی بافت استخوان برخوردارند. (15-12و11و7و5)
مواد سرامیکی دسته دیگری از بیومتریال های بکار رفته در مهندسی بافت استخوان میباشند. در میان سرامیک هایی که در این زمینه مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته اند، سرامیک های کلسیم فسفاتی وسیع ترین تحقیقات را به خود اختصاص دادهاند که معروف ترین آنها عبارتند از هیدروکسی آپاتیت، تری کلسیم فسفات، تترا کلسیم فسفات و کلسیم فسفات آمورف.(6و5) با این حال فلوئورهیدروکسی آپاتیت می تواند جایگزین مناسبی برای هیدروکسی آپاتیت باشد و نواقص آن را جبران کند. فاز معدنی مینای دندان که از آپاتیت تشکیل شده است، 04/0 تا 07/0 درصد وزنی آن فلوراید بوده و تقریبا 95 تا 97 درصد جرم خشک مینای دندان را شامل میشود. یون فلوئور در بزاق دهان و پلاسمای خون وجود داشته و برای رشد طبیعی دندان و استخوان ها ضروری می باشد. یون فلوراید قابلیت درمانی در ترمیم پوکی استخوان دارد چرا که با اعمال آن، جرم استخوان افزایش می یابد. همچنین این یون موجب تحریک فعالیت سلول های استخوانی در محیط برونتن و درونتن می شود. فلوئورهیدروکسی آپاتیت پایداری حرارتی و شیمیایی بهتری نسبت به هیدروکسی آپاتیت دارد که این پدیده با توجه به ساختار کریستالی هیدروکسی آپاتیت قابل توجیه است. فلوئورهیدروکسی آپاتیت به هنگام استفاده در جایگزین های استخوانی، زیست سازگاری و هدایت استخوانی خوبی را از خود به نمایش می گذارد.(16) نقطه قوت فسفات های کلسیم به خاصیت زیست سازگاری آنها برمی گردد که معلول تشکیل لایه غنی از کلسیم –فسفر در سطح این مواد می باشد.(17) وجود چنین لای های به اتصال شیمیایی میان استخوان و ایمپلنت کمک میکند.
تحقیقات نشان داده اند که با بکارگیری سرامیک ها در کنار مواد پلیمری، علاوه بر امکان حصول خواص مکانیکی بهتر، درجه زیست سازگاری و قابلیت استخوان سازی ایمپلنت نیز به میزان چشمگیری افزایش خواهد یافت. علاوه بر این مشکل محصولات جانبی اسیدی پلیمرها نیز برطرف خواهد شد.(19و18و16) بنابراین روشن است که با بکارگیری کامپوزیت هایی از پلیمرهای طبیعی و سرامیک های فسفات کلسیمی در ساخت جایگزین های تخریبپذیر.(22-20) میتوان ماده ای نزدیکتر به خواص استخوان طبیعی فراهم نمود.
مواد و روشها
برای سنتز نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت از روش هم رسوبی استفاده شد. در این روش از پودرهای کلسیم نیترات، دی آمونیوم هیدروژن فسفات و آمونیوم فلوراید، به عنوان مواد اولیه استفاده شد. در ابتدا پودرهای دی آمونیوم هیدروژن فسفات و آمونیوم فلوراید با نسبت مولی 3 به 1 در مقادیر مشخص آب مقطر حل شدند، سپس میزان pH محلول فسفاتی با استفاده از آمونیاک به 11 رسید. در ادامه محلول فسفاتی به صورت قطره قطره به محلول کلسیم نیتراتی (نسبت کلسیم به فسفر 67/1 مول) اضافه گردید. محلول حاصل پس از 4 ساعت قرارگیری بر روی همزن مغناطیسی، از صافی عبور داده شد و رسوبات حاصل از آن با آب مقطر شست و شو داده شدند و بعد از خشک شدن، به مدت 45 دقیقه و در دمای 700 درجه سانتیگراد کلسینه شدند. سپس محلولی از ژلاتین در آب مقطر دیونیزه شده با غلظت 10 درصد تهیه شد. پس از انحلال کامل ژلاتین، پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت به محلول اضافه گردید و محلول نهایی در دمای 60 درجه سانتیگراد و به مدت 1 ساعت به خوبی هم زده شد تا ذرات فلوئورهیدروکسی آپاتیت به طور کاملا یکنواخت در محلول ژلاتین پراکنده شوند. با تغییر مقادیر فلوئورهیدروکسی آپاتیت افزوده شده، نسبت های وزنی مختلف 40، 50 و 60 درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت به ترتیب برای نمونه های S1، S2 و S3 طبق جدول 1 بدست آمد. علاوه بر این، فلوچارت تهیه نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت که به روش هم رسوبی به منظور اختلاط با ژلاتین تهیه شد، در تصویر 1 قابل مشاهده میباشد.
|
حل کردن آمونیوم فلوراید و دی آمونیوم هیدروژن فسفات در آب |
|
حل کردن کلسیم نیترت در آب |
|
اضافه کردن محلول حاوی فسفات به محلول حاوی کلسیم |
|
قرارگرفتن محلول نهایی روی همزن مغناطیسی به مدت4 ساعت |
|
شستشوی رسوبات بدست آمده و خشک کردن |
|
کلسینه کردن |
تصویر 1 : نمودار تهیه نانو پودر فلوئورهیدروکسیآپاتیت به روش همرسوبی
جدول 1 : ترکیب شیمیایی نمونهها
|
نمونه |
درصد وزنی FHA |
درصد وزنی ژلاتین |
|
S1 |
40 |
60 |
|
S2 |
50 |
50 |
|
S3 |
60 |
40 |
سپس در دمای منفی 57 درجه سانتیگراد و به مدت 24 ساعت، نمونه ها تحت عملیات خشکایش انجمادی قرار گرفتند. پس از انجماد بچ ریخته شده، لایه بدست آمده به ابعاد مطلوب بریده شد و در درجه حرارت اتاق به مدت 24 ساعت رها شد تا کاملا خشک گردد. سپس هریک از قطعات حاصله به مدت دوساعت در محلول گلوتارآلدئید قرار داده شدند تا در این فاصله اتصالات عرضی لازم در شبکه ژلاتینی رخ دهد و آن را تبدیل به ژلاتین نامحلول نماید تا در اثر تماس با رطوبت دچار تغییر ساختار و خواص نشود. پس از شبکه ای شدن ژلاتین، نمونه ها جهت شست و شو و حذف بقایای گلوتارآلدئید، به مدت 24 ساعت در آب مقطر شست و شو داده شدند. سپس نمونه ها به مدت 8 ساعت در درجه حرارت اتاق رها شدند تا رطوبت اولیه آنها گرفته شود و خشک گردند و سپس در دمای 40 درجه سانتیگراد رطوبت نهایی نمونه ها گرفته شد. شکل 2 تصویری از داربست ژلاتین/ فلوئورهیدروکسی آپاتیت میباشد که به روش خشکایش انجمادی تهیه شده است.
تصویر 2 : تصویر داربست ژلاتین- فلوئورهیدروکسی آپاتیت سنتز شده به روش خشکایش انجمادی
به منظور تعیین ساختار کریستالی و ترکیب شیمیایی فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ژلاتین و داربستهای کامپوزیتی از روش پراش پرتو ایکس (XRD, BRUKER, D8-Advance model, Germany) استفاده شد. الگوهای پراش با پرتو CuKα و با سرعت روبش 0058/0 درجه بر ثانیه در محدوده زاویهای (90–10) تهیه شدند و شناسایی الگوها با استفاده از کارتهای مرجع تشخیص فاز (JCPDS) انجام گرفت.
برای اطمینان از ایجاد پیوند بین گروه‌های عاملی ژلاتین و فلوئورهیدروکسی آپاتیت، مقادیر مشخص از هر نمونه آماده‌سازی شد و توسط طیف‌سنج مادون قرمز(FTIR, SHIMADZU, 8400S model, Japan) با KRS-5prism با زاویه 45 درجه استفاده شد. طیف IR در محدوده طول موج cm−1500 تا 4000 پدیدار شد.
به منظور بررسی ریزساختار پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت سنتز شده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM, Philips, XL30 model, Poland) استفاده شد. علاوه بر این از داربست ها و سلو لهای اتصال یافته به داربست ها در بزرگنمایی های مختلف توسط دستگاه SEM عکس گرفته شد.
سلول استخوان ساز ردهMG-63 (بانک سلولی انستیتو پاستور، ایران) با استفاده از محیط کشت (DMEM, Gibco, Scotland) و افزودن 10 درصد سرم جنین گوساله (FCS, Seromed, Germany) به همراه آنتی بیوتیک به میزان IU/ml100 پنی سیلین و µg/ml100 استرپتومایسین (Sigma, USA) تکثیر گردید تا سلول برای دو نوع ارزیابی چسبندگی و رشد و تکثیر سلولی آماده گردد.
برای بررسی های زیست سازگاری و میزان بقاء سلول ها از آزمون عصاره گیری غیرمستقیم (MTT, Sigma, Saint Louis, USA) استفاده شد. همچنین شرایط محیط کشت تا حد امکان مشابه بدن، دمای 37 درجه سانتیگراد و pH خنثی در بازه های زمانی 3 و 7 روز انجام شد. علاوه بر این، در این روش ابتدا عصاره گیری از نمونه های داربست انجام میگیرد. بنابراین عصاره نمونه های مختلف در زمان های مورد نظر تهیه شد. بدین صورت که به ازای هر 5 میلیگرم داربست، 1 سیسی محیط کشت افزوده شد و نمونه ها در انکوباتور تحت رطوبت 95 درصد و گاز CO2 5 درصد نگهداری شدند. سپس در فواصل زمانی 3 و 7 روز محیط خارج و به سلول ها اضافه گردید و مقدار مشخصی محیط کشت نیز به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. شرایط محیط عصاره گیری تا حد امکان مشابه با شرایط محیط بدن است به همین منظور ابتدا 104×1 سلول درون پلیت کشت سلولی 96 چاهکی ریخته شدند و به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا سلول ها به کف پلیت بچسبند. عصاره گرفته شده از هر نمونه به چاهک کشت افزوده و سلول ها به مدت 24 ساعت دیگر در مجاورت این عصارهها قرار گرفتند. پس از آن محیط کشت خارج شد و 100 میکرولیتر RPMI بدون رنگ به همراه 10 میکرولیتر محلول MTTبا غلظت 12 میلیمولار به هر چاهک وارد شد. پس از گذشت 4 ساعت محلول روی سلول ها خارج گشت و DMSO (D2650, Sigma, Saint Louis, USA) به آنها اضافه گردید تا بلورهای بنفش رنگ ایجاد شده حل شوند. سپس مقدار غلظت ماده حل شده در DMSO، با استفاده از دستگاه الایزا ریدر(Stat Fax-2100; GMI, Inc., Miami, FL, USA) در طول موج 545 نانومتر محاسبه شد و در نهایت میزان زندهمانی سلولی از رابطه زیر بدست آمد.چاهک دارای سلول های بیشتر چگالی نوری (OD) بالاتری نسبت به چاهک با سلول کمتر نشان می دهد. بنابراین میتوان از رابطه زیر مقدار سلول را مشخص کرد و با نمونه شاهد مقایسه نمود.
ODs
رابطه (1) : -------- = درصد زندهمانی
ODc
در رابطه (1)، ODsبرابر میانگین چگالی نوری هر نمونه در زمان مورد نظر و ODc برابر میانگین چگالی نوری گروه کنترل میباشد.
سنجش فعالیت آلکالین فسفاتازی داربست های ساخته شده در روزهای سوم، هفتم و چهاردم بعد از کشت سلولی، بر روی داربست ها ارزیابی شد. نمونه ها با استفاده از سونیکیت کردن در 5/0 میلیلیتر بافر لیزکننده یکنواخت شدند و مخلوط حاصل به مدت 10 دقیقه با دورrpm 12000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید. مواد حاصل از تخریب سلولی با 5/0 میلیلیتر محلول بافر آلکالین مخلوط شدند. بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه، 1 میلیلیتر سور 5/0 نرمال، جهت توقف برهم کنش به مخلوط فوق، اضافه و جذب در 405 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. فعالیت آلکالین فسفاتازی بر حسب نسبت اعداد نانومول PNP تبدیل شده در دقیقه به میلی گرم پروتئین کل محاسبه شد. و نهایتاً مقدار پروتئین کل با استفاده از الیزا کیت (پارس آزمون، ایران) اندازه گیری گردید.
به منظور انجام آزمون مکانیکی دستگاه انجام آنالیز مکانیکی (Zwick/Roell, Z050 model, Germany) مورد استفاده قرار گرفت. به همین منظور داربست های کامپوزیتی با سنباده پرداخته شده و به صورت نمونه های استاندارد برای آزمون استحکام مکانیکی در آمدند. سه نمونه با درصدهای وزنی متفاوت از فلوئورهیدروکسی آپاتیت (40، 50 و 60) آماده شدند و نمودار تنش-کرنش، استحکام تسلیم، فشاری و مدول یانگ، به ترتیب رسم و اندازه گیری شدند.
برای محاسبه ی نسبت تورم، داربست های تهیه شده به مدت 24 ساعت در آب قرار گرفتند و وزنگیری شدند.
میزان جذب آب با توجه به فرمول زیر محاسبه گردید:
Wt - Wo
رابطه (2) : -------- = میزان جذب آب
Wo
با توجه به فرمول (2)،Wt وزن داربست متورم شده در زمان های مشخص و Wo وزن خشک اولیه داربست میباشد.
به منظور تحلیل نتایج حاصل از ارزیابی های زیستی، تجزیه و تحلیل آنالیز واریانس یک طرفه با استفاده از نرم افزار آماری SPSS انجام گرفت و نتایج بدست آمده بصورت نمودارهای ستونی در مایکروسافت اکسل 2010 رسم شدند. همچنین سطح معنی داری در آزمون ها 05/0 ≥Pدرنظر گرفته شد.
یافته ها
تصویر 3 الگوی پراش پرتو ایکس نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ژلاتین و داربست های کامپوزیتی ژلاتین/ فلوئورهیدروکسی آپاتیت را نشان می دهد. تغییرات فازی نانو پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت کلسینه شده در دمای 700 درجه سانتیگراد به وسیله آزمون XRD مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به تصویر 3 اغلب قله های اصلی مربوط به فاز آپاتیت از جمله قله های (211)، (002) و (300) به وضوح دیده میشوند. به دلیل تشابه زیاد ساختار بلوری و ابعاد واحد شبکه، همه قله های فلوئورآپاتیت و هیدروکسیآپاتیت به طور دقیق قابل تمایز از یکدیگر نیستند. نتایج نشان داد که به جز فاز آپاتیت سایر فازهای ناخواسته در ترکیب پودر تولیدی حضور ندارند. مشخص است که برخی پیکها با ورود یون فلوئور به ساختار آپاتیتی، به سمت زوایای بالاتر شیفت پیدا می کنند. شیفت پیک های مشخصه آپاتیت در اثر حضور یون فلوئور در ساختار آپاتیت ناشی از کاهش پارامتر شبکه a در اثر جایگزینی نسبی یون فلوئور به جای گروه های هیدروکسیل، که دارای شعاع یونی بزرگتری نسبت به یون فلوئور هستند، می باشد. علاوه بر این همانطور که در تصویر 3 قابل مشاهده است، الگوی پراش بدست آمده از داربست های کامپوزیتی نشان دهنده تشکیل نوعی فاز بلوری است ولی از آنجا که فاز آپاتیتی آمیخته با ژلاتین است شدت قله های بدست آمده نسبت به قله های فلوئورهیدروکسی آپاتیت پایین هستند. بررسی قله های ثبت شده در مقایسه با کارت های XRD مربوط به ترکیبات کلسیم فسفاتی موجود در پایگاه داده ای ICDD و استفاده از نرمافزار شناسایی فازها که قله های بدست آمده را با اطلاعات ثبت شده برای ترکیبات مختلف مقایسه کرده و تحلیل می کند، اثبات کرد که فازهای تشکیل شده در داربست از نوع آپاتیتی، مخصوصا فلوئورهیدروکسی آپاتیت است. یک پیک وسیع تپه مانند در الگوی پراش ژلاتین در ناحیه 20=θ2 نیز قابل مشاهده است که نشان دهنده ساختار کریستالی مارپیچ سه تایی در ژلاتین است و شبیه کلاژن نیز میباشد.(24و23)
تصویر 3 : الگوی پراش پرتو ایکس نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، داربستهای کامپوزیتی و ژلاتین
در تصویر 4 نتایج آزمون FTIR برای نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ژلاتین و داربست های کامپوزیتی با درصدهای مختلفی از فلوئورهیدروکسی آپاتیت (40 درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت، 50 درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت و 60 درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت) نمایش داده شده است. با توجه به طیف بدست آمده از پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، پیک اضافه ای که بیان کننده جایگزینی گروه های عاملی ناخواسته در ترکیب آپاتیت یا حضور ناخالصی ها باشد، وجود ندارد. در فلوئورهیدروکسی آپاتیت سنتز شده ساختار آپاتیت با طول موج های cm-1610-560 و cm-11100-950 مشاهده می شود. همچنین یک پیک کوچک در طول موج cm-1960 که مربوط به باند فسفاتی ساختار آپاتیت است در ساختار فلوئورهیدروکسی آپاتیت دیده میشود. در واقع آنچه ساختار هیدروکسی آپاتیت را از فلوئورهیدروکسی آپاتیت متمایز میکند، باندهای مرتبط با گروه های هیدروکسیل شبکه ای در طول موج های cm-1633 و cm-13570 می باشد. چهار پیک مرتبط با ارتعاشات V1، V2، V3 و V4 از گروه های فسفاتی در ترکیب آپاتیت به روشنی قابل تشخیص هستند. پیک های مرتبط با ارتعاشات V1 و V2به ترتیب در cm-1961 و cm-1 454 ظاهر شده اند. پیک مشاهده شده در موقعیت cm-1 745 مشخصه زنجیر هیدروکسیلی است که در ساختار آپاتیت، غنی از فلوئور شده و تاییدی است بر جایگزین شدن کامل گروه های هیدروکسیل در ساختار آپاتیت با یون فلوئور که در نتایج سایر پژوهش ها نیز حضور این پیک گزارش شده است. ارتعاش V3از ارتعاشات مربوط به گروه های فسفاتی، که شدیدترین ارتعاش موجود در میان ارتعاشات معرف فسفات در ترکیب آپاتیت است، نیز در محدوده طول موج cm-1 1100-1000 به صورت یک پیک گسترده با شدت بالا مشاهده شد. با توجه به طیف سنجی مادون قرمز داربست های کامپوزیتی دستهای از اعداد موجی (1450، 1540، 1650) که شاخص ترین آنها مربوط به آمید نوع اول و دوم است، ناشی از حضور ژلاتین بوده و اعداد موجی (cm-1 560، 1040) مربوط به باندهای ارتوفسفات نیز حاکی از شکلگیری رسوب آپاتیتی در میان ژلاتین است. ظهور قله در عدد موجی 1345 چنانکه در منابع دیگر هم بیان شده است، به علت شکل گیری پیوند مابین گروه های کربوکسیل از ژلاتین و یون کلسیم از آپاتیت میباشد. همانطور که در طیف سنجی مادون قرمز ژلاتین مشاهده می شود، باند موجود در ناحیه cm-1 3457 مربوط به حضور آب و آمید A میباشد. پیک های موجود در 1657، 1544 و cm-1 1236 به ترتیب مربوط به آمید I، آمید II و آمید III می باشند. علاوه بر این پیک های موجود در محدوده 1350 تا cm-1 1480 مربوط به باند ارتعاشی گروه متیل میباشند.(27-25)
تصویر 4 :طیفهای مادون قرمز نانوذرات نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ژلاتین و داربستهای کامپوزیتی
تحقیقات در زمینه مهندسی بافت نشان داده است که محدوده تخلخل بهینه برای مهندسی بافت استخوان برابر با 300-100 میکرومتر است. تحقیقات انجام شده و داده های حاصل از اندازه حفرات و پراکندگی آنها بیانگر این موضوع است که داربستها برای کابردهای مهندسی بافت استخوان مناسب میباشند. تصاویر بدست آمده از سطح کامپوزیتها، نشان دهندهی وجود تخلخل بالا با حفره های منظم، مشابه ساختار لانه زنبوری و تقریبا هم اندازه در کنار یکدیگر و مرتبط باهم هستند. قطر تخلخلها در بازه 100 تا 350 میکرومتر قرار میگیرد. تصویر 6 تصاویر SEM از پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت را نشان می دهد. در این تصویر مشاهده می شود که ذرات تشکیل شده اند و کروی شکل هستند و در بعضی نقاط حالت توده ای پیدا کردهاند. نتایج بدستآمده از تصاویرSEM در تصویر 5 و 7 و آنالیز داده ها با استفاده از نرمافزار Image J نشان می دهد که در داربست با بیشترین درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت میانگین قطر تخلخل برابر با 3/31±58/81 میکرومتر است. همانطور که در شکل مشاهده می گردد با افزایش درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت در ساختار داربست، میانگین اندازه قطر تخلخل کاهش یافته است. علاوه بر این میتوان دریافت که علت کاهش درصد تخلخل با افزایش میزان فلوئورهیدروکسی آپاتیت به ماهیت و چگونگی ایجاد تخلخل ها و تمایل ذاتی ژلاتین به اسفنجی شدن خودبه خودی در اثر انحلال در آب بر میگردد. میانگین اندازه قطر تخلخل در داربست 50 درصد وزنی FHAو 40 درصد وزنی FHA به ترتیب برابر 48/34±99/94 و 54/58±75/180 میکرومتر است، همچنین پراکندگی اندازه تخلخل ها روی نمودار تصویر 7 نشان می دهد که با افزایش میزان فلوئورهیدروکسی آپاتیت در ساختار داربست ها، توزیع تخلخل ها بهسمت تخلخل های ریزتر نیز میرود. تصاویر SEM موید وجود مسیرهای ارتباطی مابین حفره های ایجاد شده می باشند و در مجموع با توجه به بازه اندازه تخلخل ها و ارتباط حفره ها به یکدیگر میتوان گفت داربست های کامپوزیتی بدست آمده از این نظر، تا حد زیادی خصوصیات یک داربست مطلوب مورد استفاده در مهندسی بافت استخوان را دارند.
علاوه بر این مورفولوژی سلول ها پس از قرارگیری داربست ها به مدت 7 روز در محیط کشت در تصویر 8 نشان داده شده است. همانطور که در تمامی نمونه ها دیده می شود سلول ها بوسیله پایک های کاذب به درون تخلخل ها نفوذ کرده و به سطح داربست چسبیده اند و تشکیل لای های سلولی را دادهاند.
|
د |
|
ج |
|
ب |
|
الف |
تصویر 5 : تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی داربستهای کامپوزیتی. الف و ب به ترتیب مربوط به تصاویر مقاطع افقی و عمودی داربستها میباشند. ج و د نیز مربوط به مقاطع مشخصی از داربستهای کامپوزیتی میباشند
تصویر 6 : تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از نانو پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت کلسینه شده در دمای 700 درجه سانتیگراد
|
الف |
|
ب |
|
ج |
تصویر 7 : نمودار توزیع قطر تخلخل و تصاویر SEM از داربستها. الف) 40 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ب) 50 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت و ج) 60 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت
تصویر 8 : تصاویر SEM چسبندگی سلولها بر داربستهای: الف) 60 درصد وزنی FHA، ب) 50 درصد وزنی FHA و ج) 40 درصد وزنی FHA
نمودار 1 میزان بقای سلولی برای نمونه های مختلف را با آزمون اندازه گیری میزان سمیت سلولی با روش غیرمستقیم در مقایسه با نمونه کنترل (C) و در زمانهای مختلف نشان م یدهد. همانطور که مشاهده میشود، زندهمانی همه داربستها بالای 90 درصد میباشد و با افزایش درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت در ساختار داربست، میزان زنده مانی افزایش یافته است. این نتایج نشان دهنده زیست سازگاری داربست های ساخته شده میباشد و میتوان گفت که این داربستها هیچ اثر سمیتی روی سلولهای MG-63 ندارند. تصاویر SEM و نتایج عصاره گیری نشان میدهند که داربست های کامپوزیتی ساخته شده با درصدهای مختلف آپاتیت زیست سازگارند و مناسب برای کاربردهای مهندسی بافت استخوان می باشند. لازم به ذکر است که مقدار P-value برای مقادیر بدست آمده کمتر از 05/0 بود که نشان دهنده ی معنی دار بودن داده های بدست آمده است.
آلکالین فسفاتاز، یک اکتوآنزیم است که به وسیله سلول های استئوبلاست تولید می شود. برخی معتقدند که این آنزیم در تخریب پیروفسفات معدنی مشارکت می کند تا یک غلظت موضعی کافی از فسفات یا پیروفسفات معدنی، به منظور فرآیند معدنی شدن، فراهم نماید. در میان آزمون های بیولوژیکی مختلف برای تخمین میزان فعالیت استئوبلاستها درون داربست ها، ترشح آلکالین فسفاتاز، آزمونی مهم است. فعالیت آلکالین فسفاتازی سلول های استئوبلاست کشت شده بر روی داربست های کامپوزیتی ساخته شده از ژلاتین وفلوئور هیدروکسی آپاتیت، با سه نسبت مختلف فلوئورهیدروکسی آپاتیت، در روزهای سوم، هفتم و چهاردهم کشت سلولی در نمودار 2 قابل مشاهده است.
بر اساس نمودار، فعالیت آلکالین فسفاتازی بین روز سوم، هفتم و چهاردهم از تفاوت معنی داری برخوردار است. تفاوت چشمگیر در فعالیت آلکالین فسفاتاز در داربست ها، می تواند به این علت باشد که در داربست با غلظت های بالاتر فلوئورهیدروکسی آپاتیت چسبندگی و تکثیر سلول ها بر روی داربست ها افزایش مییابد.
نمودار 1 : نتایج آزمون MTT برای داربستهای کامپوزیتی ژلاتین- فلوئورهیدروکسی آپاتیت با نسبتهای مختلف از فلوئورهیدروکسی آپاتیت بعد از سه و هفت روز (05/0*P≤)
نمودار 2 : فعالیت آلکالین فسفاتازی سلولهای استئوبلاست کشت شده بر روی داربستهای کامپوزیتی ژلاتین - فلوئورهیدروکسی آپاتیت با نسبتهای مختلف فلوئورهیدروکسی آپاتیت در روزهای سوم، هفتم و چهارهم بعد از کشت سلولی (05/0*P≤)
سه نوع نمونه برای بررسی خواص مکانیکی داربست ها آماده شد و نمودار نیرو بر حسب جابه جایی هر نمونه بدست آمد و با استفاده از آن، مقادیر تنش و کرنش در هر لحظه محاسبه و نمودار تنش برحسب کرنش برای هر سه نمونه ترسیم شد. تصاویر 11-الف تا 11-ج، نیز نمودار تنش-کرنش هر سه نمونه را نشان می دهند. نمودار شامل سه قسمت الاستیک، پلاستیک و فشردگی است. با توجه به تصویر 11 قسمت الاستیک برای هر سه نمونه، ناحیه قبل از نقطه تسلیم می باشد که تنش و کرنش با یکدیگر تا حدودی رابطه خطی دارند و با توجه به این ناحیه مدول یانگ برای نمونه ها محاسبه گردید. همانطور که در تصویر 11 قابل مشاهده است ناحیه پلاستیک برای هر سه نمونه در محدوده نقطه تسلیم تا ایجاد فشردگی و شکست در نمونه ها واقع شده است. منظور از قسمت فشردگی قسمتی است که در آن افزایش مجدد تنش پس از له شدگی نمونه رخ می دهد. در واقع این قسمت به علت وقوع شکست در ساختار متخلخل داربست بوجود آمده است که با افزایش تنش حفره های داربست به تدریج پر شده و کرنش افزایش یافته است و این افزایش تا زمانی ادامه پیدا می کند که تمامی حفره ها پر شده و داربست به یک سازه توپر تبدیل شود و پس از آن تنش به طور ناگهانی افزایش می یابد.(28)
|
الف |
|
ب |
|
ج |
تصویر 11 : نمودار تنش-کرنش داربستهای کامپوزیتی (الف- 60 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ب-50 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت و ج- 40 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت)
همچنین مدول یانگ داربستهای کامپوزیتی در ناحیه الاستیک با استفاده از معادله 3 محاسبه شد.
s
رابطه (3) : ------E=
e
در معادله فوق E مدول یانگ، sتنش و eکرنش اعمالی به هر کدام از داربستهای کامپوزیتی میباشد.
مدول یانگ و استحکام تسلیم به طور میانگین برای نمونه ها 40 و 7 مگاپاسکال بدست آمد. این مقادیر چند برابر مقادیر گزارش شده در داربست های مشابه است.(29) در واقع علت این تفاوت، تشکیل بلورهای آپاتیت در ساختار داربست است. علاوه بر این تشکیل بلورهای آپاتیت باعث افزایش سطح آزاد و در نتیجه افزایش ناحیه تماس فاز تقویت کننده با فاز زمینه شده و استحکام مکانیکی آنها را چند برابر میسازد. همچنین با توجه به نتایج حاصل از طیف سنجی فروسرخ، وجود نوعی پیوند شیمیایی بین فلوئورهیدروکسی آپاتیت و ژلاتین که موجب تقویت خواص مکانیکی کامپوزیت شده است قابل تایید است که این مکانیزم در داربست های مشابه گزارش نشده است.(30) نهایتا با مقایسه این داده ها می توان دریافت که با افزایش میزان فلوئورهیدروکسی آپاتیت در ساختار داربست ها خواص مکانیکی نیز مانند خواص بیولوژیکی بهبود یافته است.
جدول 2 : مدول یانگ داربست ساخته شده در این پژوهش در مقایسه با استخوان اسفنجی، استخوان فشرده و یک داربست دیگر
|
نمونه |
مدول یانگ (MPa) |
استحکام تسلیم (MPa) |
|
داربست کامپوزیتی ژلاتین/ FHA |
3 14آ±"> 40 |
5/0 14آ±"> 7 |
|
داربست کامپوزیتی ژلاتین/HA (29) |
39/0 14آ±"> 01/4 |
65/0 |
|
استخوان فشرده(31) |
103 14أ—"> 30-2 |
130-180 |
|
استخوان اسفنجی (31) |
500-50 |
4-12 |
با تعیین وزن داربستها قبل و پس از قرارگیری در داخل آب مقطر به مدت 24 ساعت میزان جذب آب داربستها اندازه گیری شد. که به صورت خلاصه و به منظور سهولت مقایسه در جدول 3 نشان داده شده است. با مقایسه اعداد جدول میتوان مشاهده کرد که با افزایش درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت در ساختار داربست کامپوزیتی، میزان جذب آب داربست افزایش مییابد.
جدول 3 : میزان جذب آب سه نوع داربست ساخته شده در مقایسه با یکدیگر
|
درصد جذب آب (%) |
نوع نمونه |
|
380 |
40FHA |
|
491 |
50FHA |
|
672 |
60FHA |
بحث
موفقیت در ساخت داربست های مورد استفاده برای جایگزینی بافت استخوان تنها در صورتی به طور کامل حاصل می شود که داربست ساخته شده از جهات مختلف نظیر خصوصیات شیمیایی، فیزیکی، بیولوژیکی و مکانیکی شبیه به بافت استخوان باشد. با توجه به پیچیدگی بافت استخوان و خصوصیات منحصر به فرد آن، گردآوری تمام این خواص در کنار یکدیگر در یک مجموعه خارج از بدن تنها در صورتی امکان پذیر است که شباهت قابل توجهی بین آن محیط خارجی با محیط بیولوژیکی بدن وجود داشته باشد. طبق آنچه که در قسمت مقدمه بیان شد، امروزه تحقیقات زیادی در این راستا در حال انجام است. به نظر میرسد میزان موفقیت هر داربست مهندسی بافت، به میزان نزدیکی مجموعه طراحی شده به مجموعه مشابه خود در محیط بیولوژیکی بستگی دارد. شرایط به کار گرفته شده برای ساخت داربست مهندسی بافت در این پژوهش از چند دیدگاه شبیه به شرایط بدن انتخاب شد که عبارتند از:
1- تشکیل فاز معدنی (فلوئورهیدروکسی آپاتیت) در شرایط مشابه بدن از نظر دما و pH.
2- استفاده از ژلاتین که از نظر فیزیکی به عنوان نوعی سازه اولیه شبیه ساز ماده زمینه خارج سلولی و از نظر شیمیایی به علت شباهت به کلاژن، به عنوان جایگزین غضروف پیش استخوانی متشکل از کلاژن در بدن، عمل می کند. دلیل استفاده از ژلاتین به عنوان سازه زمینه، شباهت ساختاری این پلیمر به جزء آلی استخوان است که غالبا از کلاژن تشکیل شده است.
3- استفاده از فرآیند خشکایش انجمادی در مطالعات اخیر نیز مورد توجه قرار گرفته است. از ویژگی های بسیار مهم بافت استخوان که سبب بوجود آمدن خصوصیات ویژه ای برای این بافت شده نحوه چینش یا قرارگیری اجزای تشکیل دهنده در کنار یکدیگر به ویژه نحوه قرارگیری فاز معدنی بر روی زنجیرهای کلاژنی در لا به لای استخوان است. ایجاد این نظم در استخوان مستلزم رخداد فرآیندهای وابسته به نفوذ یون ها از دیواره عروق و ماده زمینه خارج سلولی به سمت محل شکل گیری استخوان است که لزوما فرآیند زمانبری است.
از روش خشکایش انجمادی بیشتر برای مطالعه چگونگی روند معدنی کردن در بدن و ساخت داربست های ژلاتین و هیدروکسی آپاتیت استفاده شده است، بنابراین تا زمان نگارش این مقاله، گزارشی بدین مضمون به چاپ نرسیده است. از این رو میتوان اظهار نمود که نوآوری پژوهش انجام شده به طور عمده بکارگیری فلوئورهیدروکسی آپاتیت و روش خشکایش انجمادی برای ساخت داربست کامپوزیتی ژلاتین / فلوئورهیدروکسی آپاتیت بوده است.
مطالعه عکس های SEM گرفته شده از نمونه ها حکایت از وجود ساختاری متخلخل با حفره های در محدوده مورد قبول برای مهندسی بافت استخوان دارد. حفره ها غالبا دارای یک ساختار بیضوی شکل هستند و در بسیاری از نقاط نیز، ساختاری به هم مرتبط از خود نشان میدهند. این ویزگی برای رشد و نفوذ بافت استخوانی به درون داربست بسیار حائز اهمیت است. اگرچه ساختار به هم مرتبط تخلخل ها در اکثر نمونه ها قابل مشاهده است، ولی میتوان گفت با افزایش درصد FHA، علاوه بر کاهش تعداد حفره ها در واحد سطح، ارتباط بینابینی آنها نیز کاهش مییابد. بعلاوه در نمونه های با FHA کمتر، ساختار بیضوی شکل تخلخل ها نسبت به نمونه های دارای FHA بالاتر، بیشتر حفظ شده است. نکته جالب توجه در مورد کلیه این نمونه ها این است که تخلخل ایجاد شده در ساختار آنها به صورت کاملا خود به خودی و بدون افزودن هیچ نوع عامل تخلخل سازی صورت پذیرفته است. در واقع انحلال طبیعی ژلاتین در آب خود باعث ایجاد این تخلخل گشته است.
تصاویر سلول های استئوبلاستی کشت داده شده بر روی داربست کامپوزیتی در تصویر 8 نشان داده شدهاند. این تصاویر دلالت بر این واقعیت دارند که سلول های کشت یافته به خوبی به درون حفره های داربست نفوذ کرده و بر روی سطح دیواره تخلخلها رشد نمودند. چسبندگی سلولها به سطح زیرین، مهاجرت و ترشح ماده زمینه خارج سلولی، هم بر روی سطح سلولها و هم روی سطوح داخلی داربست مشاهده شد. اندازه مناسب حفرات داربست، امکان نفوذ سلولهای استخوانی به درون آنها را فراهم کرده است. ترشح ماده زمینه خارج سلولی، باعث ایجاد سطحی ناصاف روی سطح سلولها شده است. در تصویر 8 سلول های نفوذ کرده به درون یک حفره و تمایل به مهاجرت سلولی روی سطوح داخلی حفرات داربست را به خوبی نشان میدهد. این مشاهدات نشان میدهند که داربست کامپوزیتی ساخته شده قابلیت ترغیب و هدایت رشد سلولهای استخوانی را داراست. در بحث بررسی سمیت سلولی، همانگونه که در تصویر 9 مشاهده میشود، حضور داربستهای کامپوزیتی سبب افزایش رشد و تکثیر سلولهای استئوبلاست شده است. در واقع مواد حاصل از تخریب نمونه ها، نه تنها اثر سمیت برای سلولها نداشته اند، بلکه سبب بهبود عملکرد سلولها، رشد و تکثیر بیشتر آنها شده اند. حضور فاز کلسیم فسفاتی در ساختار داربستها نیز به علت تشابه بسیار زیاد ساختار آن با استخوان طبیعی بدن و آزاد سازی مواد و یون های مشابه بدن، سبب رشد و تکثیر سلولهای استخوانی می شود.
در ارزیابی آلکالین فسفاتاز، میزان آلکالین فسفاتاز ترشح شده از سلولهای استئوبلاست قرار گرفته در مجاورت داربستها پس از فواصل زمانی مشخص ارزیابی شد. نتایج بدست آمده از این آزمون همانطور که در تصویر 10 قابل مشاهده است، بیانگر فعالیت سلولهای استخوانی و هدایت استخوانی نمونه ها میباشد که ظرفیت بالای داربست کامپوزیتی ژلاتین فلوئورهیدروکسی آپاتیت با درصدهای مختلف از فلوئورهیدروکسی آپاتیت، برای استفاده در مهندسی بافت استخوان را تایید میکند.
علاوه بر این، خصوصیات مکانیکی بدست آمده از آزمون فشاری در مقایسه با داربست مشابه بررسی شده در یک مطالعه دیگر(28) بسیار برتر بوده و به استخوان اسفنجی شبیه تر است. در اندازه گیری میزان تورم داربستها نیز مشاهده شد که با افزایش درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت در داربست کامپوزیتی ژلاتین/ فلوئورهیدروکسی آپاتیت، میزان جذب آب افزایش یافته است. علت این افزایش جذب آب را می توان در تفاوت ساختار فلوئورهیدروکسی آپاتیت و ژلاتین دانست زیرا فلوئورهیدروکسی آپاتیت دارای گروه های آب دوست است.
با توجه به نتایج آزمون های بیولوژیک، آزمون های خواص مکانیکی و شناسایی گروه های عاملی و نسبت تورم، میتوان گفت که داربست های کامپوزیتی ژلاتین / فلوئورهیدروکسی آپاتیت در مجموع خواص مناسبی داشتند و چسبندگی مناسب و افزایش رشد سلولهای MG-63 بر روی داربستهای کامپوزیتی ژلاتین / فلوئورهیدروکسی آپاتیت را باعث شدند و از قابلیتهای لازم به منظور کاربرد در مهندسی بافت استخوان برخوردار بودند. نتایج این تحقیق بر اساس آزمایشها در خارج از محیط بدن بوده لیکن میتواند نتایج مشابهی را با آزمایش های درون بدن نشان دهد.
نتیجه گیری
تصاویر میکروسکوپی داربست کامپوزیتی ژلاتین – فلوئورهیدروکسی آپاتیت، تخلخل های به هم مرتبط را نشان دادند که برای رشد و تکثیر سلولهای استئوبلاست مناسب میباشند. همچنین، نتایج بدست آمده از آزمونهای بیولوژیکی و مکانیکی نشان دادند که با افزایش غلظت فلوئورهیدروکسی آپاتیت میزان زندهمانی، فعالیت آلکالین فسفاتازی سلولها و استحکام داربستها افزایش یافته است. بنابراین داربستهای کامپوزیتی ساخته شده در این پژوهش، کاندیدای مناسبی برای کاربرد در مهندسی بافت استخوان هستند. همچنین کار تحقیقاتی آینده ما پیرامون بحث های بالینی و بیرون بدنی فراورده حاصل از این تحقیق خواهد بود.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مقاله بر خود لازم میدانند از دانشکده مهندسی مواد و متالورژی دانشگاه سمنان به دلیل حمایت از مقاله حاضر تشکر نمایند.
)