نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار گروه آسیب شناسی دهان، فک و صورت دانشکده دندانپزشکی و مرکز تحقیقات دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی مشهد
2 دانشیار گروه جراحی دهان، فک و صورت دانشکده دندانپزشکی و مرکز تحقیقات دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی مشهد
3 دانشیار گروه آسیب شناسی دهان، فک و صورت دانشکده دندانپزشکی و مرکز تحقیقات دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی مشهد
4 متخصص پزشکی اجتماعی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی مشهد
5 دستیار تخصصی گروه آسیب شناسی دهان، فک و صورت دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی مشهد
6 دندانپزشک
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Dentigerous cyst (the most common developmental cyst), periapical cyst (the most common jaw cyst) and residual cyst may transfer to neoplasm. In this study, the expression of P53 & MDM2 (cell proliferative regulators) and their relation to proliferation and transformation of these cysts were evaluated.
Materials & Methods: In this cross-sectional study, expressions of P53 and MDM2 markers in 60 samples of paraffin blocks (20 samples for each cyst) were examined by Immunohistochemistry method and the percentage, intensity, and location of involved epithelial cells were evaluated. Statistical tests included one way ANOVA and Tukey test for evaluation of expression, and Kruskal-Wallis for intensity comparison and Kendall for detecting correlation between markers.
Results: Periapical cyst showed complete expression of markers. Severity, percentage and depth of MDM2 expression were higher than P53. Marker expression for residual cyst was highly intensive and also in full thickness of epithelium, but it was basillary with lower intensity in dentigerous cyst. Expression of P53 and MDM2 had significant differences in these three cysts (P=0.01,0.03 respectively), and also significant difference for percentage and severity of MDM2 between the three groups (P=0.003,0.001 respectively). There was a positive linear correlation between P53 and MDM2 expression (P<0.001).
Conclusion: In residual cyst, there was a correlation between increase in MDM2and P53 expression, but not in periapical cyst. Dentigerous cyst failed to strongly express each of the markers. Nevertheless, it could be said that increase in expression of these markers could be related to pathogenesis and neoplastic transformation of these cysts.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
کیستها و تومورهای ادونتوژنیک بخش مهمی از ضایعات فکی و دهانی راتشکیل می دهند زیرا به جز چند استثناء تقریبا در تمام موارد کیستهای حقیقی در داخل استخوان فک اتفاق می افتد. این ضایعات از بقایای اپی‌تلیوم ادونتوژنیک در مراحل مختلف ادنتوژنزیس بوجود می آیند. کیستهای دندانی اصولاً به دو دسته اصلی کیستهای التهابی و رشدی تکاملی تقسیم گردیده و رفتارهای بیولوژیک متنوعی دارند.(1) کیست دنتی‌جروس که همراه دندان نهفته دیده می شود، شایع‌ترین کیست تکاملی فکی محسوب می‌گردد و نمونههایی از آن دارای رشدهای وسیعی بوده و با نرخ تبدیلی 25% دومین کیست دارای پتانسیل تغییرات کارسینوماتوز می‌باشد. از یک سو کیست پری‌آپیکال شایع‌ترین کیست دندانی بوده که گاهی می‌تواند با تخریب استخوان به اندازه بزرگی برسد و از طرفی در صورت باقی ماندن آن پس از خارج نمودن دندان نکروزه عامل تبدیل به کیست رزیجوال میشود که این کیست، شایع‌ترین کیستی است که توانایی تغییرات بدخیمی یانئوپلاستیک را دارا می‌باشد.(3و2) باتوجه به منشاء التهابی و تکاملی این کیستها و شیوع بسیار زیاد آنها در میان کیستهای دیگر و نیز داشتن بالاترین استعداد تبدیل شدن به بدخیمی در آنها، تصمیم به مطالعه رفتارهای بیولوژیک آنها از طریق بررسی دو فاکتور P53 که فاکتور مهارکننده رشد سلولی بوده و MDM2 که تنظیمکننده منفی آن است و نسبت به سایر نشانگرهای پرولیفراتیو درون سلولی ارتباط بیشتری با P53دارد، گرفته شد تا شاید بتوان کیستهایی که دارای پتانسیل بیشتری برای تغییرات نئوپلاستیک هستند را پیدا نموده و توانایی بروز رفتارهای گوناگون آنها را توجیه نمود.(6-4) علاوه بر تحقیقات فراوانی که بر روی این نشانگرها در ضایعات دیگر مناطق بدن انجام شده، شاهد مطالعاتی خاص بر روی ضایعات کیستیک و تومورال ادنتوژنیک نیز می باشیم، بطوری که Piattelli فقط P53 را بر روی کیستها بررسی کرد(7) و Carvalhis و Thosaporn به مقایسه هر دو نشانگر بین ضایعات کیستیک با تومورال پرداختند.(9و8)
اما هدف از این مطالعه بررسی ارتباط بین تظاهر هر دو نشانگر MDM2 و P53 با فعالیت تکثیری و ترانسفورماسیون احتمالی کیستهایی می باشد که هر کدام از نظر شیوع یا میزان استحاله نئوپلازیک شاخص می‌باشند، و چون نشانگرهای MDM2و P53به عنوان شاخص های مهم تکثیر و تنظیم سیکل سلولی ارتباط نزدیکی با هم دارند، لذا در این مطالعه تصمیم به بررسی اثرگذاری آنها در هر یک از کیستهای فوق گردیده تا شاید بتوان تمایل به رشد بیشتر و تغییرات نئوپلازیک در آنها را مورد مقایسه و ارزیابی قرار داد.
مواد و روش ها
در این مطالعه توصیفی- تحلیلی که تمام نمونه‌های آن از آرشیو بخش پاتولوژی دانشکده دندانپزشکی مشهد تهیه شده، 60 نمونه متشکل از 20 بلوک پارافینی از هر یک از کیستهای دنتی‌جروس، رادیکولار و رزیجوال انتخاب گردید. کلیه نمونهها توسط دو پاتولوژیست مورد بازبینی قرار گرفته و در صورت بروز هر گونه شبهه، ضایعه از سبد نمونهها حذف گردید. سپس از هر نمونه دو برش به ضخامت 4 میکرون جهت بررسی به کمک روش ایمنوهیستوشیمی استرپتاویدین بیوتن (LSAB) تهیه گردید و آنتیبادی مونوکلونال موشی ضد P53 (دانمارک DAKO cytomation) و آنتیبادی موشی ضد MDM2 ساخت کارخانه Novo castra) انگلستان) طبق دستورالعمل کارخانههای سازنده مورد استفاده قرار گرفتند.
برشهای بافتی پس از پارافین زدایی توسط گزیلل و آبدهی از الکل مطلق تا 70 درجه و جهت مهار پراکسیداز داخلی در آب اکسیژنه 3/0% به مدت 10 دقیقه قرار داده شده سپس به منظور بازیافت آنتیژنی برشها را در محلول سیترات بافر گذاشته و ابتدا هفت دقیقه در مایکروویو با قدرت 100% به دلیل رسیدن به نقطه جوش و بعد پانزده دقیقه با قدرت 40% برای باقی ماندن در همان درجه و سپس پانزده دقیقه در هوای اتاق جهت سرد کردن قرار داده می شوند. پس از این مرحله در حد فاصل مراحل بعدی که به ترتیب شامل: افزودن آنتیبادی اولیه، آنتیبادی ثانویه Link، استرپتاوویدین بیوتین، کروموژن و هماتوکسیلین مایر (Mayer) جهت رنگ‌آمیزی می‌باشد، به منظور شستشو و رقیقسازی از محلول (ph=7.6 و
145 mmol/1Nacl، 20 mmol/1Tris) Tris-buffered solution استفاده شد. نهایتاً لامها با الکل مطلق آبگیری شده و با چسب انتلان مانته گردید.
اسلایدهای رنگ‌آمیزی شده با میکروسکوپ نوری با درشتنمایی 400 و 100 برابر تحت مطالعه قرار گرفته و با استفاده از مقایسه با نمونه شاهد مثبت (آدنوکارسینوم کولون برای P53، لنف نود راکتیو برای MDM2) از صحت رنگ‌آمیزی اطمینان حاصل گشت. نمونههایی که هسته سلولها به رنگ قهوهای در نیامده بود، به عنوان نمونه منفی در نظر گرفته شدند.
نمونهها بر اساس تعداد سلولهای رنگ پذیرفته به انواع: کمتر از 5% رنگ گرفته= منفی، بین 5-25% برابر یک مثبت و نمونه‌های بیش از 25% بعنوان دو مثبت در نظر گرفته شدند.(3)
از لحاظ شدت رنگ‌پذیری نشانگرها، رنگ‌پذیری هسته سلول ها به سه دسته ضعیف، متوسط و شدید تقسیمبندی شدند.(3)
موقعیت بروز P53 و MDM2 به تفکیک محل در سه منطقه بازالی، 2/1 ضخامت و تمام ضخامت اپی تلیوم کیست بررسی گردیده است.
در این مطالعه از نرمافزار SPSS با ویرایش 13 و آزمون آماری One way ANOVA به منظور مقایسه میزان تظاهر P53 یا MDM2 در گروههای مورد مطالعه استفاده شد. از آزمون آماری Kurskal-Wallis برای مقایسه درجه‌بندی یا شدت رنگ‌پذیری P53 یا MDM2 در بین سه گروه مورد مطالعه استفاده شد. از آزمون Kendall به منظور بررسی ارتباط و همبستگی بین P53 و MDM2 در ضایعات استفاده گردید.
یافته ها
در بین گروههای تحت مطالعه کیست رزیجوال از لحاظ بروز P53دارای بیشترین میانگین (6/8±8/33) و کیست پری‌آپیکال دارای کمترین میانگین (44/7±05/6) بودند. میزان بروز این نشانگر در کیستهای رزیجوال و رادیکولار در تصاویر 1 و 2 نشان داده شده است.
با توجه به آزمون ANOVAOne Way اختلاف معنی‌داری از لحاظ بروزP53 در گروه های تحت مطالعه وجود داشت (16/8F= و 001/0P=) (جدول 1). در ضمن با استفاده از آزمون Tukey میانگین درصد رنگ‌پذیری P53 در دو مورد مقایسه گروه های پری‌آپیکال با رزیجوال و رزیجوال با دنتی‌جروس دارای تفاوت معنی‌داری (001/0P=) می باشد.
جدول 1 : میانگین و انحراف معیار درصد سلول های اپی‌تلیالی P53مثبت
|
|
تعداد |
میانگین |
انحراف معیار |
|
پری‌آپیکال |
20 |
05/6 |
124/5 |
|
رزیجوال |
20 |
8/33 |
11/34 |
|
دنتی‌جروس |
20 |
1/16 |
16/16 |
|
کل |
60 |
6/18 |
15/24 |
مقایسه رنگ‌پذیری P53در لایه‌های مختلف اپی‌تلیوم به دلیل حجم کم نمونهها در هر یک از ضایعات مذکور امکان‌پذیر نبود و از لحاظ درجه‌بندی و شدت رنگ‌پذیری P53در بین گروههای تحت مطالعه اختلاف معنی‌داری دیده نشد.
بیشترین میانگین درصد بروز MDM2در بین گروههای تحت مطالعه در ضایعات پری‌آپیکال (6/8±5/32) و کمترین آن در کیست دنتی‌جروس (44/7±4/13) بود که این میانگین در کیستهای پری‌آپیکال و دنتی‌جروس در تصاویر 3 و 4 به نمایش درآمده است.
تصویر 1 : بروز زیاد P53 در کیست رزیجوال
(درشتنمایی X100)
تصویر 2 : بروز کم P53 در کیست پری‌آپیکال
(درشتنمایی x 100
تصویر 3 : بروز کم MDM2 در کیست دنتی‌جروس
(درشتنمایی x400)
تصویر 4 : بروز زیاد MDM2 در کیست پری‌آپیکال
(درشتنمایی x400)
با توجه به آزمون One Way ANOVA اختلاف معنی‌داری از لحاظ بروز MDM2در گروههای مورد مطالعه وجود داشت (56/3F= و 003/0P=) و با استفاده از آزمون توکی فقط تفاوت معنی‌داری بین گروههای پری‌آپیکال و دنتی‌جروس در مقایسه دو به دو گروهها مشاهده می‌گردد (03/0P=) (جدول 2).
با توجه به اینکه حجم نمونه کم بود مقایسه رنگ‌پذیری MDM2در لایه های مختلف ضایعات مورد مطالعه امکان‌پذیر نبود.
اختلاف آماری معنی‌داری از لحاظ درجه‌بندی MDM2بین سه گروه تحت مطالعه وجود داشت. (003/0P= و 79/11=2Kruskal Wallis: x) (جدول 3).
همچنین اختلاف معنیدار آماری در سه گروه تحت مطالعه از نظر شدت رنگ پذیری MDM2 دیده می شود (001/0P< و 4/18x2=Kruskal Wallis:) (جدول 4).
با توجه به آزمون Kendall، P53 و MDM2 با یکدیگر ارتباط داشته و همسوی با هم عمل می‌کنند (48/0r= و 001/0P=) (نمودار 1).
جدول 2 : میانگین و انحراف معیار درصد سلول های اپی‌تلیالی رنگ‌آمیزی شده با MDM2
|
|
تعداد |
میانگین |
انحراف معیار |
|
پری‌آپیکال |
20 |
5/32 |
63/19 |
|
رزیجوال |
20 |
75/28 |
74/31 |
|
دنتی‌جروس |
20 |
40/13 |
68/16 |
|
کل |
60 |
58/24 |
60/24 |
جدول 3 : فراوانی درجه‌بندی MDM2در گروه های تحت مطالعه
بر حسب سلول های اپی‌تلیالی مثبت
|
درجه بندی |
پری‌آپیکال |
رزیجوال |
دنتی‌جروس |
کل |
|
|
- |
تعداد |
0 |
9 |
11 |
20 |
|
درصد |
0/0 |
%45 |
%65 |
%3/33 |
|
|
+ |
تعداد |
12 |
4 |
7 |
23 |
|
درصد |
%60 |
%20 |
%35 |
%3/38 |
|
|
++ |
تعداد |
8 |
7 |
2 |
17 |
|
درصد |
%40 |
%35 |
%10 |
%3/28 |
|
|
کل |
تعداد |
20 |
20 |
20 |
60 |
|
درصد |
%100 |
%100 |
%100 |
%100 |
|
جدول 4 : فراوانی شدت رنگ‌پذیری MDM2در گروه های
تحت مطالعه
|
شدت |
پری‌آپیکال |
رزیجوال |
دنتی‌جروس |
کل |
|
|
منفی |
تعداد |
0 |
2 |
3 |
35 |
|
درصد |
%0 |
%10 |
%15 |
%3/8 |
|
|
ضعیف |
تعداد |
2 |
13 |
12 |
27 |
|
درصد |
%10 |
%65 |
%60 |
%45 |
|
|
متوسط |
تعداد |
15 |
3 |
4 |
22 |
|
درصد |
%75 |
%15 |
%20 |
%7/36 |
|
|
شدید |
تعداد |
3 |
2 |
1 |
6 |
|
درصد |
%15 |
10 |
%5 |
%10 |
|
|
کل موارد |
تعداد |
20 |
20 |
20 |
60 |
|
درصد |
%100 |
%100 |
%100 |
%100 |
|
نمودار 1 : ارتباط تظاهر P53 و MDM2 در ضایعات مذکور
بحث
نشانگرهای MDM2 و P53 علاوه بر کنترل سیکل سلولی در آپوپتوزیس نیز دخیلند و با اثر تنظیمکنندگی Feed back در اغلب کانسرها بروز مییابند، بطوریکه امروزه حتی بعنوان هدف نهایی داروهای تکامل یافته ضدسرطان محسوب میگردند.(4)
مطالعات حاصله از این نشانگرها اغلب بر روی بدخیمیها می باشد و مثلا تاثیرات و ارتباطات این دو بویژه نوع وحشی P53در تحقیقات بر روی لنفوم هوچکینی و ALL به اثبات رسیده است.(6و5) اما در حیطه حفره دهان نیز مطالعات زیادی از این نشانگرها بر روی بدخیمی ها بخصوص SCC)) سرطان سلول سنگفرشی(10) شده و در مطالعه حاضر میزان بروز P53 و MDM2از نظر فراوانی سلولهای بروزدهنده و همچنین از نظر شدت بروز و عمق نفوذ (ضخامت) نشانگر در لایه‌های اپی‌تلیالی کیستهای دنتی‌جروس، رادیکولار و رزیجوال تحت بررسی قرار گرفتند. نتایج حاصله نشاندهنده معنیدار شدن اختلافات آماری از نظر بروز هر دو نشانگر در بین سه کیست تحت مطالعه می‌باشند (به ترتیب 03/0MDM2=و 01/0P53=).
یک نکته مهم در این مطالعه این است که بیشترین بروز MDM2 در کیست پری‌آپیکال مشاهده شده است (میانگین=5/32) ولی همین کیست کمترین بروز P53 را با میانگین 05/6 نشان می‌دهد. بروز MDM2 در کیست پری‌آپیکال در بیش از نیمی از موارد کل ضخامت اپی‌تلیوم را دربرگرفته و در اکثر موارد شدت بروز آن متوسط تا شدید بود، در حالیکه بروز P53 در این کیست اغلب محدود به ناحیه بازال آن هم با شدت ضعیف می‌باشد. با توجه به اینکه کیست پری‌آپیکال ماهیتاً یک کیست التهابی است، می‌توان به تاثیرگذاری احتمالی سلولهای فراوان التهابی مزمن در کوریون همبندی کیست و نفوذ آنها به درون اپی‌تلیوم پوشاننده کیست (اگزوسیتوزیس) بر روی فعالیت MDM2 اشاره داشت زیرا که به نظر می رسد این فرایند نتیجه رهاسازی واسطههای شیمیائی آماسی و تاثیر آنها بر فعالیت این پروتئین در اپی‌تلیوم است.
در عین حال نمونه‌های کمی از کیست رزیجوال از نظر بروز هر دو نشانگر منفی هم بوده‌اند، با این وجود در اکثر مواقع این کیست بروز نشانگرها را در کل ضخامت آن هم بطور شدید نشان داده است. این یافته می‌تواند مؤید رشد سلولی نسبتاً بالایی در کیست رزیجوال باشد و دلیل این که چرا درصد بالای تبدیل به نئوپلاسم را برای این کیست برخی مولفین اشاره کردهاند، توجیه می نماید.(12و11) Agarwal نیز به اثر همزمان و هماهنگ این دو نشانگر در ضایعات پیشبدخیم و SCC دهان پی برد.(13) البته این هماهنگی در مطالعات دیگر در زمینه آملوبلاستوما (خوشخیم و بدخیم) و ادنتوژنیک کراتوسیست نیز مشاهده گردید.(15و14) همچنین در مطالعه
de Araujo بر روی تومورهای غدد بزاقی دیده شد که آدنوئیدسیستیک کارسینوما که درجه بدخیمی بالایی دارد، بیشترین بروز هر دو نشانگر را هم نشان می‌دهد.(16)
کیست دنتی‌جروس که از نظر بروز P53 در رتبه دوم و از نظر بروز MDM2 رتبه آخر در این مطالعه را به خود اختصاص داده است و دارای نمونه‌های منفی از نظر بروز هر دو نشانگر اگر چه کم می‌باشد، از نظر بروز نشانگرها اغلب محدود به لایه بازال بوده و بروز ضعیف و متوسط هم دارد. میزان کم بروز P53 در کیست دنتی‌جروس در مطالعه Piattelliنیز مشاهده شده است.(7) همچنین موارد منفی مطالعه ما می‌تواند با مطالعه Carvalhis که نمونه‌هایش از نظر P53 منفی بودند نیز هماهنگ باشد.(8) اگر چه همین محقق بروز MDM2 را در کیست پری‌آپیکال از ادنتوژنیک کراتوسیست بیشتر می‌داند و این یافته او با تحقیق ما که در بین سه کیست بیشترین مقدار بروز MDM2 را در کیست رادیکولار یافته‌ایم، مطابقت دارد. تحقیقات Thosapron نیز نشاندهنده بروز بسیار کم مارکرهای تکثیر سلولی در کیست دنتی‌جروس می‌باشد(9) و Piattelli هم به میزان کمتر بروز مارکرهای رشد سلولی در کیستهای پری‌آپیکال و دنتی‌جروس نسبت به ادنتوژنیک کراتوسیست اشاره کرده است(17) و البته مطالعه 2001 او نیز نشاندهنده بروز 1/9% از P53 در کیست دنتی‌جروس و 3/8% در کیست رادیکولار است که این ارقام با یافته‌های ما در مورد کیست رادیکولار نزدیک است چون میانگین مطالعه حاضر برای بروز P53 در کیست رادیکولار 03/ 6 است ولی در خصوص کیست دنتی‌جروس به واسطه بروز 1/16% در مقابل 1/9% مطالعه Piattelli تفاوت بیشتری مشاهده می‌گردد.(7) اما نکته مشابه در هر دو مطالعه بروز بیشتر این نشانگر در کیست دنتی‌جروس نسبت به کیست پری‌آپیکال می‌باشد. از سوی دیگر Slootweg نیزمشاهده کرد که اکثر موارد مورد مطالعه‌اش با بروز P53 مثبت در انواع کیستها همراه بوده است.(18) در عین حال مشاهده بروز ضعیف P53 در کیست دنتی‌جروس در مطالعه وی با یافته‌های ما هماهنگ می باشد.
در مطالعه کنونی دریافتیم که ارتباط مثبتی بین تظاهر P53 و MDM2 مشاهده گردید.
نتیجه گیری
افزایش بروز P53 و MDM2 در کیست رزیجوال هماهنگ بود ولی این هماهنگی در کیست رادیکولار مشاهده نمیشود و از سوی دیگر هیچ یک از نمونه‌های کیست دنتی‌جروس این نشانگرها را به صورت قوی بروز ندادند ولی در مجموع می‌توان گفت افزایش بروز نشانگر می‌تواند با پاتوژنز و احتمالاً ترانسفورماسیون نئوپلاستیک آنها مرتبط باشد.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از زحمات مادی و معنوی معاونت محترم پژوهشی دانشکده دندانپزشکی مشهد و حمایت علمی مرکز تحقیقات دندانپزشکی قدردانی می گردد.
)