ارزیابی اثر ضد میکروبی کلرهگزیدین و اوژنول بر روی سلولهای پلانکتونیک و بیوفیلم استرپتوکوکوسهای ویریدانس جدا شده از پلاکهای دندانی

مقدمه

پلاک­ دندانی شامل بیوفیلم یا توده باکتری‌هایی است که بر سطوح دهان شامل سطح دندان‌ها و لثه رشد
می­کند. این لایه چسبناک ابتدا بیرنگ بوده ولی بعداً به صورت کرمی یا قهوه ای رنگ دیده می­شود.⁽¹⁾ تقریباً 80 تا 90 درصد وزن پلاک از آب تشکیل شده است، ولی 70 درصد وزن خشک آن از باکتریها و بقیه آن از
پلی­ساکاریدها و گلیکوپروتئین‌ها تشکیل شده است.⁽²⁾. استرپتوکوکوس­های گروه ویریدانس اولین گروه تشکیل دهنده بیوفیلم در دندان هستند.⁽³⁾ این باکتری‌ها شامل یک گروه نامتجانس از گونه­های استرپتوکوک بوده که ساکن طبیعی حفره دهانی و نیز بخش فوقانی دستگاه تنفسی، مجاری گوارشی و واژن هستند. اگر چه این باکتری‌ها معمولاً بیماری­زایی کمی دارند، ولی با سندرم‌های بالینی مهمی همراه بوده و از عوامل اصلی ‌اند و کاردیت‌های حاد باکتریایی هستند که پس ازدستکاری‌های دندانپزشکی و جراحی‌هایدندان و لثه ایجاد می­شود.همچنین این باکتریها از عوامل اصلی مرگ و میر ناشی از عفونت خون، شوک و سندرمهای تنفسی در بیماران نوتروپنی هستند.⁽⁴⁾استرپتوکوکوس موتانس مهمترین عضو استرپتوکوکهای ویریدانس است. از دیگر اعضای این گروه می­توان استرپتوکوک سنگوئینیسرا نام برد که بر تشکیل پلاکهای دندانی موثر است. این باکتریها در حفره دهانی افراد سالم یافت شده و می­تواند شرایط را برای رشد و سکونت میکروارگانیسمهای دیگر عامل عفونتهای دندانی مانند استرپتوکوک موتانس فراهم کند. در صورت ورود به خون، این میکروارگانیسمها می­توانند سبب اندوکاردیت نیز بشوند.^{(6, 5)} به همین دلیل مقابله با این میکروارگانیسمها می­تواند سبب افزایش کیفیت زندگی و بهبود وضعیت سلامت شود. به این منظور، امروزه مواد ضدمیکروبی متفاوتی در بازار عرضه شده است که کاربردهای گوناگونی را در بهداشت دهان و دندان و دندانپزشکی دارند.⁽⁷⁾ با تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی عوامل ضدمیکروبی و درک تغییرات مقاومت میکروارگانیسمهای هدف، در گذر زمان می­توان به کنترل و درمان بیماریهای پریودنتال و عفونتهای ناشی از آن کمک کرد. کلرهگزیدین در سال 1940 در صنایع شیمیایی سلطنتی انگلستان (ICI) در هنگام سنتز ترکیبات ضدمالاریایی کشف شده است. مشتق دی گلوکونات این ترکیب در سال 1954 به عنوان ترکیب آنتی­سپتیک تجاری موضعی عرضه شده است.⁽⁸⁾ از آن زمان به بعد کاربردهای بسیار متنوعی از این ترکیب در عرضه ابزارآلات پزشکی مانند صابون، دهان شویه، ایمپلنت، لباسهای یک بار مصرف، کاتتر و ژل روان کننده برای تزریق سوند عرضه شده است. اوژنول یک ترکیب فنیل پروفن و از دسته ترکیبات فنیل پروپانوئیدها است. این ترکیب کمی زردرنگ و یکی از اسانسهای روغنی گیاهان میخک، دارچین، جوزهندی و برگ بو است. این ترکیب به عنوان عطر، مواد معطره و اسانس روغنی استفاده
می­شود. نمک روی این ترکیب به عنوان ترکیب آنتی سپتیک و آرام کننده موضعی درد در پانسمان دندان مورد استفاده قرار می­گیرد.⁽⁹⁾

با توجه به فقدان مطالعات پیشین، هدف این مطالعه، مقایسه میزان اثر بخشی کلرهگزیدین و اوژنول به عنوان یکی از پرکاربردترین ترکیبات آنتی­سپتیک دهانی بر اشکال بیوفیلمی و پلانکتونی سویه­های استرپتوکوکهای ویریدانس جداشده از دهان افراد سالم، بود.

   مواد و روشها

تعداد 20 نمونه پلاک دندانی از 20 فرد متفاوت با استفاده از سواب استریل برداشته شد و هر کدام به محیط ترانسپورت حاوی PBSدر pH 2/7  انتقال داده شد و هر کدام از نمونه ها برای جدا سازی استرپتوکوکهای ویریدانس بر روی پلیت حاوی محیط تریپتیکاز سوی آگار (Merck)تلقیح شد و به مدت 72 ساعت در انکوباتور و اتمسفر 10 درصد  CO₂ و در 37 درجهسانتیگرادگرماگذاری شد.⁽¹⁰⁾ شناسایی جدایه ها بر اساس آزمونهای استاندارد شامل شکل کلونی، فعالیت همولیتیک، رنگ‌‌آمیزی گرم، فعالیت کاتالاز، رشد در نمک 5/6 درصد، هیدرولیز اسکولین، تجزیه قندهای لاکتوز، مانیتول، سوربیتول، رافینوز، اینولین، تست MR-VP و هیدرولیز اوره انجام شد.⁽¹¹⁾

از میان 16 جدایه استرپتوکوک­ دهانی به دست آمده، دو جدایه که سرعت رشد بیشتری داشتند،جهت بررسی تشکیل بیوفیلم میکروبی انتخاب گردید و آزمونهای
بهینه سازی محیط کشت و میزان تلقیح به منظور انتخاب سویه­ای با توانایی برتر تولید بیوفیلم انجام شد. کلونیهای تک کشت خالص سویه­های استرپتوکوک­های ویریدانس جدا شده در محیط­های Mueller Hinton Agar-MHA خون­دار (Merck) و MHAبه علاوه 5% گلوکز و سوکروز (Merck) کشت شد و سوسپانسیون میکروبی با جذب نوری در طول موج 630 نانومتر (OD₆₃₀)   1/0 – 2/0 – 3/0 تهیه شد. سپس 250 میکرولیتر از محیط­های کشت MHA  خون­دار (Merck) وMueller Hinton Broth-MHB به علاوه 5% گلوکز و سوکروز (Merck) در چاهک­های میکروپلیت 96 خانه­ای ریخته شد. 50 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی استرپتوکوکهای دهانی هر نمونه به هر یک از 6 چاهک در دو ردیف سه تایی ریخته شد. به عنوان شاهد از 50 میکرولیتر محیط MHBخون­دار (Merck) و MHBبه علاوه 5% گلوکز و سوکروز (Merck) در دو ردیف سه­تایی استفاده گردید. نمونه­ها به مدت 48 ساعت در 37 درجه گرماگذاری شدند. سپس محتویات چاهکها به آرامی تخلیه شده و با سرم فیزیولوژی به آهستگی شستشو داده شد. به منظور تثبیت بیوفیلم تشکیل شده به هر چاهک، 200 میکرولیتر متانول خالص افزوده شده و به مدت  15 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. بعد از تخلیه محتوی چاهک، به میزان 200 میکرولیتر رنگ کریستال ویوله 5% افزوده شد و به مدت بیست دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. بعد از تخلیه رنگ و شستشو، اسید استیک گلاسیال 33% حجمی افزوده شد و پس از بیست دقیقه قرار گرفتن در دمای اتاق با کمک دستگاه میکروپلیت ریدر جذب هر چاهک در طول موج 630 نانومتر ثبت گردید⁽¹²⁾  هر آزمون دوبار تکرار شد. پس از بررسی، سویه مناسب با جذب نوری بالا انتخاب شد.

شناسایی نهایی سویه منتخب دارای توان برتر در تولید بیوفیلم به روش مولکولی با  آنالیز ژن  16S rRNA انجام شد. به این منظور جدایه منتخب در محیط BHI broth به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. سپس بیوماس باکتری با سانتریفیوژ از محیط کشت جدا شد و بعد از شستشو با سرم فیزیولوژی در هاون ریخته و از طریق شکستن فیزیکی با کمک روش کوبیدن زیست توده منجمد شده با ازت مایع سلولها شکسته شده و DNA آن با روش استخراج  با روش فنل- کلروفرم جداسازی شد. تکثیر DNAبا پرایمرهای عمومی 9F (AAG AGT TTG ATC ATG GCT CAG)  و 1541R (AGG AGG TGA TCC AAC CGC A) انجام شد.⁽¹³⁾. بررسی محصولات PCR، با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 8/0% صورت گرفت. محصول به دست آمده بعد از خالص سازی، در صورت مناسب بودن باندها برای توالی‌یابی، به شرکت Macrogenکره جنوبی ارسال شدند. جهت بررسی اثر مواد ضدمیکروبی بر روی سلولهای بیوفیلم، ابتدا رقتهای متوالی از مواد ضدمیکروبی مورد آزمون و محیط کشت میکروبی MHBخون­دار (Merck) تهیه و 250 میکرولیتر از این رقتها به صورت دوتایی به چاهکهای میکروپلیت اضافه شد. سپس 50 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی با  جذب نوری  2/0 در طول موج 650 نانومتر به هر چاهک اضافه شد. سایر شرایط ارزیابی تشکیل بیوفیلم مانند آن چه که در بالا گفته شد، بوده است.

به ‌منظور بررسی حداقل غلظت مهارکننده(MIC)
مواد ضدمیکروبی، درصدهای وزنی/حجمی(2/0– 06/0) از کلرهگزیدین (شرکت شهردارو، تهران، ایران) و غلظتهای (99/0-2/79) درصد وزنی/حجمی از اوژنول 99% (Grodab Chemie, Germany)در محیط MHBخون­دار تهیه گردید. سپس 2.5 میلی‌لیتر از رقتهای تهیه شده به لوله­های شیشه­ای ریخته شد و 500 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی با جذب نوری 2/0 به هر لوله اضافه شد. آزمون بر اساس روش میکرودایلوشن براث پروتکل NCCLS  انجام پذیرفت.⁽¹⁴⁾ پس از مواجه با مواد ضدمیکربی و طی شدن دوره انکوباسیون، وجود سلولهای زنده به روش میکروسکوپی و کشت بر روی محیط Blood Agar  بررسی شد.

یافته ها  نتایج حاصل از کشت اولیه نمونه­های دندانی از 20 فرد مورد مطالعه در جدول 1 نشان داده شده است. براساس نتایج آزمونهای بیوشیمیایی و مورفولوژی، از تعداد 48 جدایه رشد کرده بر روی محیط TSA، 16 جدایه متعلق به استرپتوکوکوس­های ویردانس و 32 جدایه مربوط به باکتریهای دیگر بوده است. فراوانترین جدایه­های غیراسترپتوکوک ویردانس به ترتیب استافیلوکوک اپیدرمیدیس، استرپتوکوکهای گروه D ،E. coliودیفتروئیدها بودند.

جدول1. نتایج جدایه های کشت نمونه­های بیوفیلم دندانی بر روی محیط تریپتیکاز سوی آگار

در جدول2، نتایج آزمونهای بیوشیمیایی بر روی 16 جدایه استرپتوکوک ویریدانس آورده شده است. این جدایه­ها در سه گونه S. mutans(شامل 9 جدایه)،
S. sanguinis(شامل5 جدایه) و S. parasanguinis (شامل 2 جدایه) طبقه بندی شده­اند.

جدول2. نتایج آزمون­های بیوشیمیایی 16 جدایه استرپتوکوک ویریدانس

از بین جدایه های مختلف استرپتوکوک ویریدانس، دو جدایه A1و B2که سرعت رشد بیشتری داشتند، برای ارزیابی میزان فعالیت بیشتر بیوفیلم انتخاب شدند. با توجه به ارزیابی نتایج آزمونهای توانایی تشکیل بیوفیلم، که در جدول 3 نشان داده شده است، سویه B2و محیط کشت مولر هینتون براث همراه 5% خون و میزان تلقیح
 (OD2/0) برای ادامه کار انتخاب شد.

جدول3. نتایج بهینه سازی میزان تشکیل بیوفیلم بر اساس ترکیب محیط کشت و میزان تلقیح 

 نتیجه شناسایی مولکولی به روش PCRژن 16SrRNAبر روی سویه منتخب دارای بیشترین توانمندی تولید بیوفیلم (B2)، تاییدکننده ویریدانس بودن جدایه بود. بر اساس این نتایج، این سویه متعلق به جنس استرپتوکوکوسبود و بیشترین شباهت (%98.04) را با  گونهS. sanguinis  داشت. این سویه با کد UTMC 2446  در کلکسیون میکروارگانیسمهای دانشگاه تهران نگهداری و ذخیره شده است.

  نتایج ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی دهانشویه کلرهگزیدین بر بیوفیلم و سلولهای پلانکتونی
 S.sanguinis UTMC 2446  در شکل 1 و جدول 4 آورده شده است. همانگونه که ملاحظه می­­شود حداقل غلظت مهارکنندگی سلولهای پلانکتونیک و بیوفیلم جدایه منتخب در مقابل این ترکیب به ترتیب g/100ml  14/0
و g/100ml2/0 بود. همچنین نتایج ارزیابی فعالیت ضدمیکروبی ماده ضدعفونی کننده اوژنول نشان داد، حداقل غلظت مهارکنندگی سلولهای پلانکتونی و بیوفیلم
S. sanguinis UTMC 2446  در مقابل این ترکیب، به ترتیب %2/79 و 99%  بود.

جدول4. مقایسه حداقل غلظت مهار کننده رشد(MIC) برای کلرهگزیدین و اوژنول علیه سلول­های پلانکتونی و بیوفیلم S. sanguinis UTMC 2446   جدا شده از دهان

(+) رشد میکروبی، (-) عدم رشد میکروب

شکل1. ارزیابی میزان تاثیر کلرهگزیدین و اوژنول بر سلولهای بیوفیلم و پلانکتونیS. sanguinis UTMC 2446   جدا شده از دهان.

A: بررسی اثرکلرهگزیدین برS. sanguinis  به ترتیب از چپ به راست غلظتهای 2/0- 18/0 - 16/0 - 14/0 -0- 12/0 -0- 1/0- 0- 8/0 -0- 6/0  W/V%  درصد وزنی/حجمی– شاهد منفی (محیط کشت)- شاهد مثبت (باکتری ومحیط کشت) به صورت دوتایی.  B : بررسی اثر اوژنول بر S. sanguinis  به ترتیب از چپ به راست غلظتهای 99- 1/89- 2/79- 3/69- 4/59- 5/49- 6/39- 7/29  ٪- شاهد منفی (محیط کشت)- شاهد مثبت (باکتری ومحیط کشت) به صورت دوتایی.C : بررسی تشکیل بیوفیلم میکروبی S. sanguinis در محیط مولر هینتون براث خون دار به همراه سوپرناتانت با OD:2/0 D: شاهد منفی تشکیل بیوفیلم میکروبی  (محیط کشت). E: بررسی تشکیل بیوفیلم میکروبی S. sanguinis در محیط مولر هینتون براث باسوکروز و گلوکز ۵٪ به همراه سوپرناتانتOD: 2/0 .

 بحث

گزارشهای متعدد نشان می­دهد که اوژنول و کلرهگزیدین کارایی مناسبی برای ضدعفونی کردن دندان وجلوگیری از عفونتهای پریودنتال دارند.^{(16, 15)}. در این گزارش‌ها نشان داده شده که تاثیر اوژنول بر استرپتوکوکهای دهانی محدود بوده است. در اغلب پژوهش‌های انجام شده اثرات ضد میکروبی بیوسایدها بر روی فرم پلانکتونی استرپتوکوکهای ویریدانس مورد بررسی قرار گرفته است، حال آن شکل پلانکتونی در زندگی میکروبی اهمیت بالینی محدودی دارد و بدن ما در اغلب موارد با سلولهاای بیوفیلم میکروبی مواجه است. بی­توجهی به این شکل زندگی سبب اختلال در روند پیشگیری و درمان می­گردد.⁽¹⁷⁾ مهمترین یافته پژوهش کنونی این است که جهت ممانعت از رشد
 S. sanguinis در حالت بیوفیلم کلرهگزیدین در غلظت g/100ml  2/0 و اوژنول دردرجه خلوص  99%  ضروری است، ولی این ترکیبات بر روی سلولهای پلانکتونی به ترتیب با غلظت  g/100ml  14/0 و 2/79%  اثربخش
بوده اند. از سوی دیگر اغلب پژوهشهای پیشین بر روی نمونه­های کلکسیونی صورت گرفته است.^(23-18و15) و پژوهشهای معدودی بر روی سویه­های استرپتوکوک ویریدانس بالینی انجام شده است.^(26-24و16) با این وجود پژوهشی که در آن اثربخشی این دو ترکیب بر روی سلولهای بیوفیلمی و پلانکتونی با منشاء بالینی مقایسه شود، دیده نشده است.

حقیقی و همکارانش⁽¹⁶⁾ مقایسه اثرات ضد میکروبی ده گونه گیاهی را با کلرهگزیدین بر علیه  Streptococcus mutans، Candida albicans و Aggregatibacter actinomycetemcomitans  مقایسه کردند و نشان دادند که عصاره گیاهی تاثیر مناسبی بر باکتریهای مورد آزمایش در مقایسه با دهان شویه کلرهگزیدین دارد.⁽¹⁶⁾ یاقوتی خراسانی و همکارانش⁽¹⁵⁾  اثر دو دهانشویه تیمول و کلرهگزیدین را بر علیه  S. mutans و S. sanguinis
تهیه شده از کلکسیون میکروبی بررسی کردند که هر دو دهانشویه در حذف باکتریها بخصوص S. sanguinisاثر داشته اند. در مطالعات دیگری اثر اوژنول بر بیوفیلم
 C. albicans مورد بررسی قرارگرفته است در این مطالعه اوژنول با غلظت   mg/l500  بر بیوفیلم مخمر موثر بوده است.⁽²⁷⁾ حسینی وهمکاران⁽²⁴⁾  اثر عوامل ضدمیکروبی بر سلولهای پلانکتونی وبیوفیلمS. mutans جدا شده از نمونه های بالینی را بررسی کردند و نتایج بررسی نشان داد برای ریشه کنی بیوفیلم غلظت  g/100ml  2/0 از کلرهگزیدین ودر مورد سلولهای پلانکتونی غلظت g/100ml  095/0 مناسب است.⁽²⁴⁾ نتایج این تحقیق در مورد سلولهای بیوفیلم استرپتوکوکهای ویریدانس با نتایج تحقیق حاضر منطبق است، اما بر اساس نتایج این پژوهش برای حذف سلولهای پلانکتونی این باکتریها غلظت بالاتری از کلرهگزیدین به نسبت پژوهشهای پیشین مورد نیاز است. همچنین مطالعاتی توسط Didry و همکاران⁽¹⁹⁾ در خصوص استفاده توام از ماده ضدعفونی کننده اوژنول و آنتی سپتیکهای تیمول و کارواکرول انجام شده که نشان داد اوژنول به تنهایی و به صورت توام با این مواد خاصیت ضدعفونی کنندگی خود را حفظ می­کند. در مطالعاتی که توسط ابراهیمی کهریز سنگی و همکاران⁽²⁸⁾ بر روی اثر کلرهگزیدین بر عفونتهای بیمارستانی انجام شد نتایج  نشان داد که استفاده از کلرهگزیدین در غلظتهای مناسب (MIC) می تواند از تشکیل بیوفیلم در گونه های مختلف باکتریهای عامل عفونتهای بیمارستانی جلوگیری کند، اما دوزهایی از کلرهگزیدین که کمتر از MIC  هستند می­توانند محرک تولید بیوفیلم باشند.

باتوجه به اینکه تاکنون تحقیقی در مورد مقایسه اثر اوژنول بر روی فرم پلانکتونی و بیوفیلم باکتریهای
دهانی صورت نگرفته، مقایسه نتایج حاصل با تحقیقات دیگران میسر نمی باشد، زیرا سایر مطالعات انجام شده فقط بر روی فرم پلانکتونی استرپتوکوکهای دهانی بوده است.^{(21- 9و9)}.

 در پژوهش حاضر اثر مهارکنندگی رشد رقتهای مختلف دهان شویه پرکاربرد کلرهگزیدین 0.2 درصد و اوژینول خالص که به طور گسترده در دندانپزشکی مورد استفاده قرارمی گیرد، بر روی سلولهای بیوفیلم و پلانکتونی S. sanguinis  مورد بررسی قرار گرفت. از نتایج حاصل از این مطالعه چنین بر می آید که دهان شویه کلرهگزیدین درغلظتg/100ml 2/0 و اوژنول در درجه خلوص 99% توانایی مهار رشد سلولهای بیوفیلم
 S. sanguinisرا دارند. در حالی که در سلولهای پلانکتونی این باکتری کلرهگزیدین در غلظتg/100ml    14/0 واوژنول در غلظت 2/79% توانایی مهار رشد دارد. به علت نفوذ کمتر آنتی بیوتیک در درون بیوفیلم و نیز تغییرات ژنتیکی و متابولیکی و ماتریکس خارج سلولی، سلولهای بیوفیلم مقاومت بیشتری نسبت به مواد ضدمیکروبی در مقایسه با سلولهای پلانکتونی دارند.⁽²³⁾

نتیجه گیری

 با توجه به نتایج به دست آمده، لزوم دقت در واحدهای کنترل کیفی ترکیبات آنتی سپتیک برای کلرهگزیدین درغلظت  g/100ml 2/0 واوژنول در درجه خلوص  99% بسیار ضروری به نظر می رسد. اهمیت این نکته با توجه به اینکه این غلظتها، معادل با غلظت این ترکیبات در فراورده های تجاری است، بیشتر می شود. به عبارت دیگر در صورت بروز یک جهش احتمالی و بروز مقاومت در استرپتوکوکهای دهانی، ترکیبات تجاری حاوی غلظت کمتری برای کشندگی استرپتوکوکهای ویریدانس خواهد بود، که همانگونه که در بالا گفته شد، می­تواند سبب بروز مقاومت بیشتر شود.  بنابراین پایش مجدد و دوره ای این ترکیبات ضدعفونی کننده از نظر عملکرد و درک میزان مقاومت برای جلوگیری از شیوع عفونت های پریودنتال توصیه می­شود. انجام آزمایش و ارزیابی اثر در شرایط بالینی می تواند سبب کارآمدی فراتر نتایج پژوهش کنونی بشود.

 تشکر و قدردانی

نویسندگان از خانمها فائزه الماسی، فهیمه محمدنیا و لیلا پرویزی که نقش شایانی در پیشبرد این مطالعه
داشته اند، تقدیر و تشکر می کنند.

.