نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار گروه آموزشی پاتولوژی دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه جندی شاپور اهواز، اهواز، ایران
2 دانشجوی دندانپزشکی عمومی، دانشگاه جندی شاپور اهواز، اهواز، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: CD44 is a cell surface adhesion glycoprotein found in various cells. The present study aimed to evaluate the immunohistochemical expression of CD44 in the erosive lichen planus (ELP), epithelial dysplasia (ED), and oral squamous cell carcinoma (OSCC) to compare the expression in a possible premalignant lesion, a definite premalignant lesion, and a malignancy.
Materials and Methods: In this descriptive-analytical study, immunohistochemical staining was performed on 10 ELP cases (without dysplasia), five ED cases, and 20 OSCC cases using the standard Envision technique. In addition, the extent and intensity of CD44 staining and thickness of the stained epithelium were assessed. Data analysis was performed in SPSS using Kruskal-Wallis test.
Results: 60% of OSCC samples had moderate membranous and cytoplasmic staining, in which more than two-thirds of the epithelium was stained. Moreover, moderate to severe, and mostly membranous immunostaining were observed in all ELP cases, while two-thirds of the epithelium showed immunostaining in all the samples. In the ED samples, staining intensity was reduced in more severe cases, and the staining pattern changed from membranous to cytoplasmic and membranous. Furthermore, in 80% of the ED cases, two-thirds of the epithelium was stained. Comparison of the immunostaining in ELP, ED, and OSCC samples indicated no significant differences between these lesions
Conclusion: According to the results, CD44 expression in ELP, ED, and OSCC had no statistically significant difference. Therefore, this protein might not be an appropriate marker to confirm the premalignancy of ELP or predict the invasion in OSCC and premalignant lesions.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
کارسینوم سلول سنگفرشی دهان
OSCC (Oral Squamous Cell Carcinoma) شایعترین بدخیمی حفره دهان است که از اپیتلیوم سطحی دیسپلاستیک منشاء میگیرد. سلولها یا تودههای سلولی مهاجم ممکن است به نواحی مختلف گسترش یابند و در حین پیشرفت بافت اصلی را تخریب کنند. (1)
دیسپلازی تغییراتی است که در قسمت بازال و پارابازال اپیتلیوم آغاز میشود. این تغییرات غیرمعمول میتواند کل ضخامت اپیتلیوم را درگیر کند و بر اساس میزان درگیری اپیتلیوم به سه نوع خفیف، متوسط و شدید رتبهبندی میشود. تغییرات هیستوپاتولوژیک اپیتلیوم مانند تغییرات اپیتلیوم در است و شامل افزایش حجم هسته و سلول، پلئومورفیسم هسته و سلول، افزایش نسبت هسته به سیتوپلاسم و میتوزهای متعدد و غیرطبیعی است. حضور دیسپلازی شدید اپیتلیوم نشانگر ریسک قابل توجه گسترش بدخیمی میباشد.(2)
لیکن پلان دهانی( ) یک ضایعه مزمن
پوستی- مخاطی نسبتاَ شایع در میان افراد میانسال و سالمندان میباشد. این بیماری از نظر تظاهرات بالینی دارای طیف گسترده و متفاوتی از ضایعات خفیف بدون درد کراتوتیک سفیدرنگ تا زخم و اروژن‌های دردناک میباشد. (3)
احتمال تغییرات بدخیمی در لیکن پلان از موضوعاتی است که پاتولوژیستها و محققین در مورد آن توافق نظر ندارند. هر چند برخی، این ضایعه به ویژه نوع اروزیو آن را پیشبدخیم می‌دانند، عدهای دیگر پروفایل مولکولی آن را به اپیتلیوم نرمال شبیهتر از اپیتلیوم دیسپلاستیک
می دانند.(4)
یک گلیکوپروتئین غشایی و دارای ایزوفرمهای متنوع تا است که در نتیجه بیان متفاوت ایجاد میشود.(5) این پروتئین به عنوان یک فاکتور مهم در تداخلات سلولی و چسبندگی سلول شناخته شده است و در سطح سلولهای مختلفی از جمله: سلولهای خونی، اپیتلیال، فیبروبلاست، سلولهای عضله صاف و سلولهای گلیال یافت میشود.(6) در حالت نرمال به هیالورونیک اسید متصل میشود تا ارتباط با ماتریکس خارج سلولی پایدار شود. سلولهای تومورال از طریق نیز به هیالورونیک اسید در ماتریکس خارج سلولی متصل میشوند. کاهش به علت شکستگی جزء خارج سلولی ( ) است که در تعداد زیادی از تومورهای بدخیم اتفاق میافتد. گفته
می شود که شکستگی سلولهای تومورال را از ماتریکس خارج سلولی جدا کرده و منجر به مهاجرت سلولهای تومورال و گسترش تومور و متاستاز
میگردد.(5،7) در تعدادی از مطالعات پیشین کاهش بیان این مارکر با افزایش دیسپلازی و یا کاهش تمایز در
SCC (10-8) و در تعدادی دیگر افزایش بیان آن گزارش شده است.(13-11)
با توجه به این نتایج متفاوت، هدف از انجام این مطالعه، بررسی و مقایسه بیان ایمونوهیستوشیمیایی CD44 در لیکن پلان اروزیو، دیسپلازی اپیتلیال و کارسینوم سلولهای سنگفرشی دهان میباشد.
علت انتخاب این سه ضایعه در کنار هم، از یک سو بررسی بیان CD44 در لیکن پلان اروزیو و دیسپلازی بود تا در صورت بیان با الگوی مشابه شاید تأییدی بر
پیشبدخیم بودن این ضایعه باشد. از سوی دیگر با مقایسه دیسپلازی و OSCC تا حدی نقش احتمالی این مارکر در توانایی تهاجم ضایعات پیشبدخیم مشخص گردد.
مواد و روشها
در این مطالعه توصیفی- تحلیلی، از 35 نمونه جمعآوری شده بین سال 1388 تا 1394 در بخش پاتولوژی دانشکده دندانپزشکی اهواز که شامل 10 نمونه لیکن پلان اروزیو، 5 نمونه دیسپلازی (4 مورد دیسپلازی خفیف و 1 مورد دیسپلازی شدید) و 20 نمونه کارسینوم سلول سنگفرشی دهان (8 مورد با تمایز خوب و 12 مورد با تمایز متوسط) بود، استفاده شد. نمونهها به منظور تأیید تشخیص و بررسی حضور بافت کافی، مورد بازبینی قرار گرفتند. در مورد لیکن پلان فقط از انواع اروزیو و بدون دیسپلازی استفاده شد؛ سپس مقاطع بافتی جهت آزمایش ایمونوهیستوشیمی( ) تهیه شد. رنگ‌آمیزی بوسیله روش استاندارد صورت گرفت. به طور خلاصه پس از تهیه برشها، نمونهها بر روی لامهای آغشته به مستقر شده و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفته تا خشک شدند. سپس نمونهها در پارافین‌زدایی گشته و در درجات مختلف الکل اتانول رهیدراته شدند. به دنبال آن به منظور متوقف‌کردن فعالیت پراکسیداز داخلی، نمونهها در متانول محتوی پراکسید ( 3/0 درصد به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شده و سپس توسط محلول Phosphate buffered saline(PBS) با PH=7.2 شستشو داده شدند. رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی برای CD44 (Biocare , England) بر اساس توصیه کارخانه سازنده صورت گرفت. پس از اتمام انکوباسیون با آنتیبادی اولیه، نمونه ها به همراه Polymer solution (anti-mouse) به مدت 30 دقیقه انکوبه و با PBS شستشو داده شدند. در مرحله بعد، از ماده رنگزای Diaminobenzidine Hydrochloride3,3 (DAB) که به کمپلکس آنتی‌ژن- آنتیبادی رنگ قهوه‌ای میدهد، استفاده شد. سپس نمونهها با رنگ زمینه‌ای هماتوکسیلین به صورت متضاد رنگ شده و پس از آبگیری، لامل بر روی آنها قرار داده شد. در نهایت وضعیت رنگپذیری ایمونوهیستوشیمیایی بوسیله میکروسکوپ نوری توسط پاتولوژیست بررسی شد. در این مطالعه از بافت اپیتلیوم نرمال به عنوان کنترل مثبت و عدم استفاده از آنتیبادی اولیه به عنوان کنترل منفی استفاده شد. شدت رنگ‌آمیزی با مقایسه چشمی سلولهای رنگ گرفته به رنگ نگرفته = صفر، خفیف =1، متوسط=2 و شدید= 3 رتبهبندی شد. درصد سلولهای رنگ گرفته نیز به 5 گروه 0% = 0، کمتر از 25% = 1، 50%-25%=2، 75%-50% = 3 و بیشتر از 75%=4 رتبهبندی شد. ضخامت اپیتلیوم رنگ گرفته به صورت عدم رنگپذیری=صفر، رنگپذیری تا یک سوم اپیتلیوم=1، رنگپذیری تا دوسوم اپیتلیوم= 2 و رنگپذیری تمام ضخامت اپیتلیوم=3 رتبه بندی و بررسی شد.(8،9) با توجه به رتبه ای بودن وسعت و شدت رنگپذیری و همچنین ضخامت اپیتلیوم رنگ گرفته از آزمون Kruskal-Wallis، ارتباط مقیاسهای رنگ پذیری در بین گروههای مطالعه (لیکن پلان, دیسپلازی اپیتلیالی و SCC) استفاده شده شد و P-value<0.05 به عنوان معنی داری در نظر گرفته شد.
یافتهها
رنگپذیری در ضایعات مورد مطالعه به دو صورت غشایی و یا غشایی و سیتوپلاسمی مشاهده شد. شدت و وسعت رنگپذیری نمونهها توسط CD44 به ترتیب در جداول 1و2 به تفکیک گروهها نشان داده شده است. در مورد نمونههای OSCC، شدت رنگپذیری در %60 موارد متوسط و به صورت غشایی و سیتوپلاسمی بود. نمونههای با تمایز خوب معمولا رنگپذیری شدیدتری نسبت به نمونههای با تمایز متوسط داشتند. هر چند در مراکز جزایر سلولهای اپیتلیالی در نمونههای با تمایز خوب که سلولها کراتینیزه هستند (مرواریدهای کراتینی) مانند سطح اپیتلیوم نرمال رنگپذیری مشاهده نشد (شکل1). در نیمی از نمونههایOSCC بیش از 75% سلولها رنگپذیری داشتند.
رنگپذیری در موارد دیسپلازی، با افزایش شدت دیسپلازی، از رنگپذیری فقط در غشا، به رنگپذیری غشایی و سیتوپلاسمی تغییر کرد. از نمونههای دیسپلازی مورد مطالعه، 4 نمونه دیسپلازی خفیف و یک نمونه دیسپلازی شدید نشان دادند و بیان CD44 در مورد دیسپلازی شدید، کمتر از موارد خفیف بود و حتی در قسمتهای رأس رتریجها که علائم دیسپلازی شدیدتر بود، کمترین رنگپذیری مشاهده شد (شکل2). الگوی
رنگپذیری نیز در بافت دیسپلاستیک قابل توجه بود. در بافت نرمال (نمونه کنترل مثبت) رنگپذیری در لایه بازال و پارابازال بیشتر از لایه خاردار بود، ولی در تمام موارد دیسپلازی، رنگپذیری از بافت نرمال کمتر و در همه لایهها تقریبا یکسان بود. در همه نمونههای لیکن پلان، رنگپذیری متوسط یا شدید و اغلب غشایی بود. 3/2 ضخامت اپیتلیوم در همه نمونهها رنگ گرفت. علاوه بر کراتینوسیتها، اغلب لنفوسیتها هم رنگپذیری داشتند (شکل3).
با توجه به آزمون Kruskal-Wallis ، بین سه گروه از نظر شدت رنگ پذیری (314/0= (p (جدول1)، وسعت رنگ پذیری (45/0=(p (جدول2) و ضخامت اپیتلیوم (05/0= (p (جدول3) تفاوت آماری معنی‌دار مشاهده نشد.
تصویر1. SCCبا شدت رنگپذیری متوسط تا شدید
سمت چپ:SCC با تمایز خوب: رنگپذیری شدید و اغلب غشایی و عدم رنگپذیری مرکز جزایر اپیتلیالی
سمت راست: SCC با تمایز متوسط: رنگپذیری متوسط تا شدید و اغلب سیتوپلاسمی و غشایی که تقریبا همهی سلولها رنگ گرفتهاند (بزرگنمایی 100×)
|
B |
|
A |
تصویر2. A: دیسپلازی خفیف با رنگپذیری غشایی
B: دیسپلازی شدید با رنگپذیری غشایی و سیتوپلاسمی (بزرگنمایی 100×)
تصویر 3. لیکنپلان با رنگپذیری نسبتا شدید و غشایی در بیشتر ضخامت اپیتلیوم و رنگپذیری لنفوسیتها ( بزرگنمایی 100×)
جدول1. توزیع فراوانی شدت رنگپذیری در گروههای مورد مطالعه
|
رتبه |
0 (بدون رنگ) |
1 (خفیف) |
2 (متوسط) |
3 (شدید) |
نتیجه آزمون کروسکال والیس |
|
SCC |
(0/0) 0 |
(0/5)1 |
(0/60)12 |
(0/35)7 |
31/2=x2 0/314=p |
|
دیسپلازی |
(0/0) 0 |
(0/40)1 |
(0/40)2 |
(0/20)1 |
|
|
لیکن پلان |
(0/0) 0 |
(0/0) 0 |
(0/70)7 |
(0/30)3 |
جدول2. توزیع فراوانی درصد سلولهای رنگ گرفته (وسعت رنگپذیری) در گروههای مورد مطالعه
|
رتبه |
(0/0) |
کمتر از 0/25 |
0/50- 0/25 |
0/75- 0/50 |
بیشتر از 0/75 |
نتیجه آزمون کروسکال والیس |
|
SCC |
(0/0) 0 |
(0/0) 0 |
(0/25)5 |
(0/25)5 |
(0/50) 10 |
59/1=x2 0/45=p |
|
دیسپلازی |
(0/0) 0 |
(0/0) 0 |
(0/0) 0 |
(0/80) 4 |
(0/20) 1 |
|
|
لیکن پلان |
(0/0) 0 |
(0/0) 0 |
(0/0) 0 |
(0/100)10 |
|
داده ها به وسیله (درصد) تعداد توصیف شده اند
جدول3. ضخامت اپیتلیوم رنگ گرفته
|
ضخامت |
0 |
1 |
2 |
3 |
نتیجه آزمون کروسکال والیس |
|
SCC |
0 |
0 |
(0/40)8 |
(0/60)12 |
98/5=x2 0/5=p |
|
دیسپلازی |
0 |
0 |
(0/80)4 |
(0/20)1 |
|
|
لیکن پلان |
0 |
0 |
(0/100)10 |
0 |
داده ها به وسیله (درصد) تعداد توصیف شده اند
بحث
در مطالعات پیشین، اغلب فقط شدت رنگپذیری CD44 گزارش شده است.(10, 8) البته در مواردی هم وسعت رنگپذیری (درصد سلولهای رنگ گرفته) بررسی شده است.(8)
مطالعه Ratuava و همکاران(6)، تنها مقالهای بود که همچون مقاله حاضر اختلاف آماری معنیداری در میزان بیان CD44 بین دیسپلازی و SCC گزارش نکرد و محققین اعلام کردند که از روی میزان بیان CD44v6 نمیتوان برای پیشبینی رفتار کلینیکی دیسپلازی دهانی استفاده کرد.
در مطالعه Bahar و همکاران(10) در 80 درصد ضایعات دیسپلاستیک و 100 درصد ضایعات SCC کاهش یا عدم بیان CD44 دیده شد. Simionescu و همکاران(8) ، نیز مشاهده کردند که ضایعات SCC با تمایز خوب، بیشترین میزان رنگپذیری را داشتند. موارد با تمایز متوسط، بیان کمتر CD44 و موارد با تمایز ضعیف، کمترین میزان بیان و یا حتی عدم بیان مارکر را نشان دادند. یافتههای مطالعه حاضر نیز رنگپذیری بیشتر در مواردSCC با تمایز خوب را نشان داد، هر چند که اختلاف آماری معنیداری مشاهده نشد.
در تعدادی دیگر از مقالات، نتایج متفاوتی گزارش شده است. در مطالعه Sawant و همکاران(11)، مشاهده شد که با افزایش مرحله پیشرفت بیماری، رنگپذیری ایمونوهیستوشیمیاییCD44 افزایش مییابد. نویسندگان نتیجه گرفتند که از این مارکر میتوان برای پیشبینی عود موضعی و پیشآگهی ضعیف بیماران سرطان دهان استفاده کرد.(11)
Abdulmajeed و همکاران (12)، نیز افزایش بیان CD44 درSCC دهان در مقایسه با بافت نرمال را گزارش کردند. آنها عنوان کردند که افزایش پیشرونده بیان این مارکر از بافت نرمال به سمت دیسپلازی و بدخیمی در دهان با یافتههایی در مورد بافتهای مری و معده
همخوانی دارد.Mannelli و همکاران(13) نیز افزایش بیان CD44 را در حدود 93 درصد از نمونههای SCC مشاهده کردند. CD44 یک گلیکوپروتئین غشایی است و در اتصالات سلولی و همچنین اتصال سلول به ماتریکس نقش دارد.(14) از آنجایی که در دیسپلازی اتصالات سلولی کاهش مییابند و در بدخیمی ها نیز، از بین رفتن اتصالات سلول به ماتریکس برای مهاجرت و تهاجم سلول و به دنبال آن متاستاز ضروری به نظر میرسد، منطقی به نظر میآید که با افزایش درجه دیسپلازی و همچنین با کاهش تمایز سلولها در SCC ، بیان این مارکر کاهش یابد که مشابه با مشاهدات ما در این تحقیق و همچنین
یافتههای Bahar و همکاران(10) و Simionescu و همکاران(8) میباشد. در توجیه نتایج متفاوت گزارش شده در تعدادی از مقالات همچون مطالعه Sawant و همکاران(11) و Abdulmajeed و همکاران(12) این احتمال وجود دارد که در هنگام دیسپلازی، به علت کاهش اتصالات سلولی، سلول به صورت جبرانی سعی در تولید مقادیر بیشتری CD44 کند و از آنجایی که این پروتئین به دلیل جهشهای احتمالی اتفاق افتاده نسبت به حالت نرمال تغییراتی دارد، کارایی لازم را نداشته و با وجود افزایش این پروتئین در سلول، اتصالات مؤثر برقرار نمیشود. Misra و همکاران (14)، عنوان میکنند که در واقع بسیاری از سلولهای CD44+ به اسیدهیالورونیک و ماتریکس متصل نمیشوند و اتصال CD44 به اسیدهیالورونیک بسیار اختصاصی است و به وضعیت فعال شدن CD44 بستگی دارد.(14) در نتیجه ممکن است CD44 وجود داشته باشد ولی اتصال برقرار نشود. همچنین از آنجایی که CD44 ایزوفرمهای متفاوت دارد و برخی مطالعات همچون مطالعه Ratuava و همکاران(6) روی برخی ایزوفرمهای خاص صورت گرفته است، این موضوع نیز میتواند منشأ برخی تفاوتها در نتایج باشد. در مطالعه حاضر بیان CD44 در لیکن پلان اروزیو مورد بررسی قرار گرفت. در اغلب نمونهها رنگپذیری متوسط و شدید مشاهده شد. این یافته احتمالا به نقش CD44 در التهاب مربوط میشود. همچنین رنگپذیری نسبتاً شدید در اغلب لنفوسیتهای موجود در باند لنفوسیتی زیر اپیتلیوم مشاهده شد
(شکل3).
در یک مطالعه که به بررسی 30 نمونه لیکنپلان
(15 مورد آتروفیک و 15 مورد هیپرپلاستیک) و 15 نمونه بافت نرمال پرداخته بود، مشاهده شد که بیان CD44 در افراد مبتلا نسبت به گروه نرمال افزایش داشت.(1) همچنین در مطالعه Gurkan – Kaya و همکاران(15) دیده شد که بیان CD44s به میزان زیادی در کراتینوسیتها و لنفوسیتها افزایش یافته است. CD44 پروتئین مؤثر هم در روند التهاب و هم در تومورزایی است و به نظر میرسد که نقش دوگانهای داشته باشد. به عنوان مثال هم در شروع التهاب حضور دارد و هم با حذف آن (مثلا در مدلهای آزمایشگاهی)، که انتظار میرود منجر به کاهش التهاب شود، شدت التهاب افزایش مییابد. (14)
همانطور که پیشتر عنوان شد عدهای لیکنپلان به ویژه نوع اروزیو را ضایعهای پیشبدخیم برمیشمارند.(4) در این مطالعه هر چند اختلاف آماری معنیداری بین بیان CD44 در نمونههای دیسپلازی، SCC و لیکنپلان یافت نشد، ولی در اغلب موارد، در دیسپلازی و SCC نسبت به بافت نرمال کاهش بیان دیده شد، در حالیکه در لیکنپلان افزایش بیان مشاهده شد. این یافته شاید شاهدی باشد بر اینکه پروفایل مولکولی لیکنپلان با دیسپلازی و ضایعات پیشبدخیم متفاوت است. ضخامتی از اپیتلیوم که
رنگپذیری CD44 را نشان میدهد نیز در این مطالعه مورد توجه قرار گرفت. مشاهده شد که در اغلب موارد دیسپلازی و همه موارد لیکنپلان تا 3/2 اپیتلیوم
رنگپذیری دارد و در اغلب موارد SCC بیش از 3/2 اپیتلیوم رنگپذیری دارد. در بافت نرمال مجاور نمونههای لیکنپلان و همچنین در بافت نرمال کنترل مثبت فقط
لایههای بازال و پارابازال رنگپذیری داشتند.
این یافته در مطالعات دیگر همچون مطالعه Abdulmajeed و همکاران(12) و Fitzpatrick و همکاران (16) مشاهده شد و نشاندهنده این است که فارغ از اینکه شدت رنگپذیری در نمونههای دیسپلازی و SCC و حتی لیکنپلان نسبت به بافت نرمال افزایش یا کاهش پیدا کند، الگوی رنگپذیری CD44 در بافت نرمال (محدود به لایه بازال و پارابازال) نسبت به این ضایعات (گسترش
رنگپذیری به لایههای خاردار اپیتلیوم) متفاوت است. البته به نظر میرسد همانطور که پیشتر اشاره شد این یافته مربوط به نقش CD44 در التهاب باشد. (14)
در تحقیق پیش رو محل بیان مارکر در سلول نیز مورد بررسی قرار گرفت. موارد دیسپلازی اغلب
رنگپذیری غشایی (مشابه با اپیتلیوم نرمال) داشتند که بنا بر انتظار بود زیرا محل این پروتئین در غشا سلول است. ولی در اغلب نمونههای SCC رنگپذیری هم در غشا و هم در سیتوپلاسم بود و باز هم سلولهای با تمایز بهتر فقط رنگپذیری غشایی داشتند. این یافته در مطالعه Sawant و همکاران هم مشاهده شد.(11) این موضوع نیز میتواند مربوط به تغییرات مولکولی CD44 در موارد بدخیمی نسبت به CD44نرمال باشد و اینکه با وجود افزایش ساخته شدن CD44 در سلول، به دلیل تغییرات ساختاری، امکان قرارگیری آن در محل مناسب در غشا وجود ندارد و در سیتوپلاسم تجمع مییابد. صد البته اثبات این فرضیه نیازمند تحقیقات بیشتر در این زمینه است.
نتیجهگیری
بیان CD44 در لیکنپلان اروزیو، دیسپلازی و SCC دهانی تفاوت آماری معناداری نداشت و این پروتئین احتمالا نمیتواند مارکر مناسبی جهت تأیید پیشبینی توانایی تهاجم در ضایعات پیشبدخیم و SCC باشد. بیان افزایشیافته CD44 در لیکنپلان اروزیو میتواند مربوط به نقش این مارکر در التهاب باشد.
تشکر و قدردانی
مقاله برگرفته از پایان نامه به شماره د/پ م/36/361 از دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز می باشد. بدین وسیله از معاونت محترم پژوهشی آن دانشگاه جهت تصویب و پرداخت هزینههای این مطالعه تقدیر و تشکر میگردد.
)