تغییرات بافتی در ناحیه مفصل گیجگاهی- فکی خرگوش متعاقب تزریق (rBMP2) Recombinant-Bone Morphogenetic Protein-2 موضعی طی جلو آوردن فک پایین با بایت جامپر

مقدمه

کوچکی فک پایین شایع‏‏ترین دفورمیتی دنتوفاسیال است که 65% از بیماران ارتودنسی به آن مبتلا هستند. به طور معمول درمان این دسته از بیماران ارتدنسی، در محدوده سنی رشد فعال و توسط دستگاه‏های فانکشنال صورت می‏پذیرد. اما آنچه در این میان جلب توجه می‏کند موارد شدیدی هستند که به درمان‏های معمول توسط دستگاه‏های فانکشنال پاسخ نمی‏دهند. علاوه بر این به طور اخص در تعدادی از سندرم‏های کرانیوفاسیال مواردی از دفی شنسی فک پایین به همراه مالفورماسیون‏های دیگر به چشم می‏خورد که توجه ویژه‏ای را می‏طلبد. به طور مثال می‏توان به سندرم پیرروبین اشاره نمود که دفی شنسی شدید فک پایین در بدو تولد، می‏تواند ادامه حیات را برای نوزاد چالش برانگیز سازد. همچنین در بیماران مبتلا به همی فیشیال میکروزومی  IIIو Grade II، به دلیل هیپوپلازی نسجی، فک پایین در یک سمت دچار دفی شنسی شده و باعث آسیمتری صورت می‏گردد، که این امر این بیماران را در طول زندگی نیازمند جراحی‏های عدیده و تهاجمی می‏نماید. علاوه بر این، شکستگی‏های قدیمی کندیل در سنین کودکی در صورت کاهش فانکشن نیز می‏تواند منجر به دفی شنسی ناقرینه در فک پایین گردد. ناهنجاری‏هایی که ذکر شدند از جمله مواردی هستند که به درمان‏های معمول با دستگاه‏های فانکشنال پاسخ نمی‏دهند. حال اگر در این میان بتوان از یک عامل موضعی جهت افزایش مدلینگ بافتی سر کندیل به منظور افزایش پاسخ دستگاه‏های فانکشنال بهره جست، شاید بتوان با چشم‏انداز بهتری نسبت به درمان این دسته از بیماران نگریست. ماده‏ای که در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفت، Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) بود. BMP2 جزء خانواده Transforming Growth Factor β (TGF-β) است که در رشد و رژنراسیون بافت‏های اسکلتال موثر است. تأثیر اولیه BMP2 تنظیم اجزاء کلیدی در توالی القای استخوان برای رژنراسیون بافت‏های اسکلتال می‏باشد. علاوه بر این BMP2 قادر به افزایش بروز فنوتیپ کندروژنیک است که باعث افزایش سنتز کلاژن تیپ II و پروتئوگلیکان و کاهش سنتز کلاژن تیپ I می‏شود.⁽¹⁾ BMP2 قادر به تشکیل استئوفیت و غضروف آرتیکولار است⁽²⁾ و با تحریک سلول‏های مزانشیمال اندیفرانسیه در نواحی شکستگی استخوان‏ها می‏تواند سبب پرولیفریشن سلول‏های استئوبلاستیک، کندروبلاستیک و فیبروبلاستیک شده و با تسهیل ارگارنوژنز استخوان، روند ترمیم را سرعت بخشد.⁽³⁾ از BMP2 به طور گسترده در بیماران شکاف کام (Cleft palate)، استئودیسترکشن، استئوژنزیس در شکستگی‏های مقاوم به ترمیم و ... استفاده می‏شود.^(8-4)

بنابراین درصورتی که تزریق موضعی BMP2 در سر کندیل حیوانات آزمایشگاهی بتواند باعث افزایش رسوب استخوانی و تحریک تشکیل کال استخوانی در سر کندیل و بالطبع افزایش طول فک پایین شود، می‏توان امیدوار بود که بتوان استفاده از BMP2 را در موارد مقاوم به درمان و نیز در سندروم‏های کرانیوفاسیال به نمونه‏های انسانی تعمیم داد.

هدف این مطالعه تعیین تغییرات بافتی ناحیه مفصل گیجگاهی-فکی خرگوش به دنبال تزریق موضعی
rBMP2 پس از جلو آوردن فک پایین توسط دستگاه بایت جامپر (Bite jumper) بود.

مواد و روش‏ها

این تحقیق یک مطالعه مداخله‏ای بود که به صورت مطالعه حیوانی انجام شد. حجم نمونه در هر گروه 6 عدد⁽²⁾ محاسبه شد و با توجه به تعداد کل گروه‏های مورد مطالعه (3 گروه) تعداد 18 عدد خرگوش در این تحقیق بکار برده شد.

مواد مورد استفاده شامل موارد زیر بود:

1)       rBMP225mg در فرم لیوفیلیزه (پودری) از منبع E coli و ساخت شرکت Axxora آمریکا، (شرکت فروشنده: هرمز پژوهان)- به تعداد 6 ویال

2)       آلژینات برای قالبگیری

3)       پودر آکریل فوری و مونومر

4)       داروی بیهوشی کتامین 10% و زایلازین 2%

خرگوش ها به 3 گروه به ترتیب زیر تقسیم گردیدند:

گروه اول خرگوش‏های بدون بایت جامپر و بدون تزریق داخل مفصلی (گروه کنترل)

گروه دوم خرگوش‏های دارای بایت جامپر و تزریق داخل مفصلی نرمال سالین 9/0% (گروه نرمال سالین)

گروه سوم خرگوش‏های دارای بایت جامپر و تزریق داخل مفصلی نرمال سالین 9/0% به همراه پودر
rBMP2 (گروه rBMP2)

در گروه دوم و سوم، یعنی در تعداد 12 عدد از خرگوش‏ها، بعد از بیهوش نمودن آنها، یک قالب آلژینات از فک بالای آنها گرفته شد، به طوری که دو دندان سانترال و بخشی از روگا ثبت شده بود. به کمک این قالب، یک تری اختصاصی ساخته و دستگاه بایت جامپر (Bite jumper) روی کست نهایی، با آکریل فوری جهت جلو آوردن فک پایین ساخته شد.

دستگاه به صورت یک صفحه شیبدار عمودی به سمت لینگوال بود که در سطح لینگوال دندان‏های سانترال پائین قرار می‏گرفت و به ناچار با سر دادن این دندان‏ها بسمت بالا و جلو، فک پایین در حالت پروترود قرار می‏گرفت.^(10و9)

ابتدا در محل سطح تماس مزیالی دو دندان سانترال بالا یک سوراخ ودر لبه انسیزال و سطح لبیال هم حفراتی تهیه شد (تصویر 1). سپس سطح دندان به مدت 30 ثانیه جهت حداکثر گیر مکانیکی اچ گردید و شستشو داده شد. داخل دستگاه توسط فرز، چندین شیار و سوراخ تعبیه شد. بعد از این مرحله، داخل پلاک توسط آکریل فوری و مونومر، ریلاین شد و روی سطح دندان‏ها قرار گرفت و تا ست شدن کامل اکریل در موضع نگهداشته شد (تصویر 2). این دستگاه به منظور ایجاد پروتروژن فک پایین و اورجت منفی درپایان درمان طراحی گردید (تصویر 3).

محـل تـزریق در مـطالعه Pilot با کالبدشـکافی ناحیه

مفصل تعیین گردید، همچنین در مطالعات قبلی⁽¹¹⁾، با پیدا کردن و لمس سر کندیل از روی پوست خرگوش در طی حرکات طرفی و همچنین باز و بسته کردن دهان، در همین محل تعیین شده بود، به طوری که بعد از برخورد با اولین استخوان متحرک (یا همان سر کندیل) تزریق انجام می‏شد (تصویر 4).

تصویر 1 : آماده سازی دندان‏ها

تصویر 2 : ریلاین کردن بایت جامپر جهت اتصال به دندان‏ها

تصویر 3 : ایجاد اورجت منفی و رابطه کلاس III در انتهای دوره مطالعه

تصویر 4 : انجام حرکات طرفی در فک پایین جهت برجسته شدن سر کندیل

در گروه سوم، ml5 از محلول رقیق شده rBMP2 با رقت mg/ml5 تهیه گردید. (mg25 پودر rBMP2 در 5 میلی‏لیتر محلول نرمال سالین، حل شد). در گروه سوم، 5/2 میلی‏لیتر از این محلول به طور موضعی در ناحیه سر کندیل در هر طرف تزریق شد.⁽²⁾ در گروه کنترل در دو سمت فقط 5/2 میلی‏لیتر محلول نرمال سالین تزریق گردید.

از آنجایی که تفاوتی در رشد غضروف با تزریق منفرد یا سه تزریق در روزهای متوالی گزارش نشده است⁽³⁾، ما نیز در این مطالعه از یک تزریق استفاده کردیم.

لازم به ذکر است که تمامی تزریق‏ها توسط یک نفر صورت گرفت. کل زمان مطالعه چهار ماه بود. در پایان این مدت، خرگوش‏ها توسط وایتال پرفیوژن به منظور بررسی بافت شناسی، قربانی شدند.

بعد از آماده شدن لام‏ها، تصاویر میکروگراف از برش‏های هر نمونه با استفاده از میکروسکوپ نوری (Light microscope OLYMPUS BX-4) و دوربین دیجیتالی ویژه میکروسکوپ (OLYMPUS DP-12 Camera) با بزرگنمایی x100 و x40 تهیه شد.

یافته‏ها

این مطالعه بر روی 18 خرگوش انجام گرفت. افزایش

وزن خرگوش‏ها در طول مطالعه 2000 تا 2500 گرم بود. هیچ علامتی از عفونت و آماس چه به لحاظ بالینی و چه از نظر بافت شناسی دیده نشد.

دفورمیتی دیسک (غالباً به شکل کاهش یا افزایش ضخامت دیسک) در هر سه گروه وجود داشت؛ به طوری که میزان کاهش ضخامت دیسک در گروه کنترل 24% و در گروه‏های نرمال سالین و rBMP2 به ترتیب 53% و 30% بود و افزایش ضخامت دیسک در گروه کنترل 20% و در گروه های نرمال سالین و rBMP2 به ترتیب 45% و 25% بود. (تصاویر 7-5). لازم به ذکر است که شاخص نرمال بودن دیسک، حداکثر ضخامت مشاهده شده دیسک در گروه کنترل (76% خرگوش‏های این گروه) در نظر گرفته شد، چرا که در گروه کنترل هیچ گونه مداخله‏ای در ناحیه مفصل TM صورت نگرفت.

از لحاظ بافت‏شناسی، میزان هیپرپلازی غضروف در گروه rBMP2 بیشتر از گروه کنترل بود اما بین گروه کنترل و نرمال سالین تفاوتی نبود. در گروه rBMP2 به لحاظ هیستوپاتولوژی و شهودی، قریب به 95% از نمونه‏ها در سمت چپ و راست هیپرپلازی غضروف را نشان دادند، در حالی که این میزان در گروه کنترل و نرمال سالین به میزان30% بود (تصاویر 10-8). لازم به ذکر است معیار وضعیت نرمال دیسک و ضخامت نرمال غضروف حداکثر داده‏های مشاهده شده مطابق با اطلس‏های جانورشناسی در نظر گرفته شد و وضعیتی بود که در اکثر نمونه های گروه کنترل مشاهده شد.

بحث

ما در این مطالعه، از خرگوش استفاده نموده‏ایم چرا که ساختار TMJ[1] منحصر به پستانداران است، اما در بین گروه‏های مختلف آنها فانکشن و مورفولوژی متفاوت دارد. تحقیقات مفصل گیجگاهی-فکی بیشتر بر روی حیوانات رت، خرگوش و خوک بوده است.⁽⁹⁾ مطالعات بسیاری روی TMJ خرگوش صورت گرفته است.⁽¹⁰⁾ وجود شباهت‏های بسیار بین مفصل تمپورو مندیبولار خرگوش و انسان، خرگوش را به یکی از بهترین مدل‏های حیوانی برای مطالعه سیستم ماضغه انسان مبدل نموده است. خرگوش در رابطه با ساختار عضلانی و مکانیسم‏های کنترل حرکتی به انسان شبیه است. عضله ماستر خرگوش در ساختار و فعالیت شبیه انسان است.⁽¹¹⁾ شباهت دیگر بین سیستم ماضغه انسان و خرگوش، در الگوی جویدن است که شامل حرکات در سمت کارگر و غیرکارگر می‏باشد.⁽¹²⁾ علاوه بر این بافت شناسی و آناتومی این ناحیه و به خصوص سر کندیل در هر دو بهم شبیه است.⁽¹³⁾

این مطالعه نشان داد که یک تزریق موضعی منفرد داخل مفصلی rBMP2 به همراه نرمال سالین تزریقی باعث ایجاد هیپرپلازی غضروف در مقایسه با دو گروه نرمال سالین و کنترل گردید. چهارچوب این مطالعه به منظور تقلید تزریق داخل مفصلی صورت پذیرفت و به خرگوش‏ها زمان کافی برای بازتوانی بین تزریق و مابقی درمان داده شد. یافته‏های این مطالعه و تاثیر rBMP2 در افزایش سلولاریتی غضروفی مشابه مطالعات ذیل است و یافته‏های این مطالعات را تائید می‏کند.

هیپرپلازی غضروف سر کندیل در این مطالعه بارز‏‏ترین یافته مشاهده شده بود. در فرآیند جلو آوردن فک پایین به کمک دستگاه‏های فانکشنال پرولیفریشن سلول‏های غضروفی رخ داده و استخوان سازی اندوکندرال به وقوع پیوست.

تصویر 5 : (A) غضروف بدون تغییر سر کندیل، (D) ضخامت دیسک بدون تغییر در گروه کنترل با رنگ آمیزی H & E
با درشت نمایی x40

تصویر 6 : (D) افزایش ضخامت دیسک در گروه rBMP2

با رنگ آمیزی H & E با درشت نمایی x40

تصویر 7 : D)) کاهش ضخامت دیسک در گروه نرمال سالین

با رنگ آمیزی H & E با درشت نمایی x40

تصویر 8 : غضروف سر کندیل دارای دو ناحیه هیپر پلازی غضروف (A) و بدون تغییر(B) در گروه rBMP2 با رنگ آمیزی

H & E با درشت نمایی x40

تصویر 9 : (A) هیپر پلازی غضروف سر کندیل در گروه
rBMP2 با رنگ آمیزی H & E با درشت نمایی x100

تصویر 10 : ((B غضروف سر کندیل بدون تغییر در گروه
rBMP2 با رنگ آمیزی H & E با درشتنمایی x100

اگر rBMP2 قادر به تشدید فرایند ساخت سلول‏های غضروفی باشد به نظر می‏رسد در آینده ما قادر به ارتقای نتایج درمان بیماران کلاس 2 با کوچکی فک پایین باشیم.

BMPs عضوی از خانواده TGF-β هستند. این مواد پروتئین‏های چند منظوره‏ای هستند که دارای اثرات درمانی در بیماری‏های مفصلی می‏باشند.⁽⁵⁾ مطالعات
In vivo قبلی نشان داده‏اند که تجویز اعضای خانواده TGF-β (از جمله rBMP2) به بیماران دارای آرتریت سبب تحریک ترمیم غضروف می‏شود.⁽⁴⁾ تزریق  rBMP2 در مفصل زانوی موش‏ها سبب هیپرپلازی غضروف و افزایش ساخت پروتئوگلیکان غضروف مفصلی می‏گردد⁽¹³⁾ که مشابه یافته‏های مطالعه فوق می‏باشد.

rBMP2 همچنین نقش موثری در ترمیم غضروف مفصلی زانوی خرگوش بعد از ایجاد نقایص عمدی در مفصل دارد.⁽⁴⁾ این ماده سبب تکثیر و سنتز ماتریکس توسط سلول‏های غضروفی در استئوآرتریت مفصل TM در موش‏ها می‏شود.⁽⁸⁾

علاوه بر این تجویز سیستمیک rBMP2 درخرگوش‏ها سبب کاهش ارتشاح سلول‏های آماسی و اروژن مفصل می‏شود.⁽²⁾

این پروتئین‏های مولتی فانکشنال سبب تحریک ساخت پروتئوگلیکان در کندروبلاست‏ها فعالیت آلکالن فسفاتاز پاسخ به هورمون پاراتیروئید و ساخت کلاژن نوع 2 در استئوبلاست‏ها می‏شوند و ثابت شده است که در تشکیل استخوان و غضروف نقش به سزایی دارند.^(14و13)

در یک مطالعه بررسی اثرات BMPs در فرایند ترمیم غضروف مفصلی در آرتریت، سه تزریق موضعی rBMP2 با دوز ng200 با شکست مواجه شد.⁽¹³⁾ این یافته‏ها نشان می‏دهد اثرات درمانی rBMP2 در آرتریت محدود است. بنظر می‏آید مقایسه اثرات rBMP2 در دوز‏های یکسان مشکل است چراکه دوز‏هایی از rBMP2 که بر تکثیر و تمایز سلول‏های استئوپروژنیتور اثر می‏گذارند بسیار بیشتر از دیگر سیتوکاین‏ها و فاکتورهای رشدی است.⁽¹⁵⁾

در بیماران دارای مشکلات داخلی مفصل گیجگاهی فکی نشان داده شده است که rBMP2 در کندروسیت‏های اطراف نواحی تخریب شده متمرکز است.^(18-16) این یافته پیشنهاد کرده است که rBMP2 می‏تواند در فرایند ترمیم این نوع مشکلات مفصلی موثر باشد.

rBMP2 قادر به تحریک تشکیل استخوان جدید در نواحی داخل عضلانی و داخل اسکلتی به شکل همراه با کلاژن نوع 1 می‏باشد.^(22-19)

مطالعات حیوانی زیادی توانایی خانواده BMPs را در جهت تشدید فرایند ترمیم شکستگی‏ها و نواحی استئوتومی نشان داده‏اند که مشابه با یافته‏های ما در این مطالعه بوده است. به طور مثال از خانواده BMPs بطور موفق در درمان شکستگی‏های باز تیبیا⁽⁵⁾ و عدم جوش هورمون‏های مزمن تیبیا در نمونه‏های انسانی استفاده شده است.⁽¹⁾

rBMP2 سبب تشدید فرایند ترمیم نقایص ایجاد شده در ناحیه کندیل به کمک تشکیل بافت غضروفی می‏شود، در حالی که در گروه کنترل این نقایص صرفاً با بافت فیبروز پر می‏شود.⁽²⁾

تزریق داخل مفصلی rBMP2 در مفصل زانوی Murine‏ها (یک جاندار دریایی) باعث افزایش پروتئوگلیکان غضروف می‏‏شود.⁽¹³⁾

بارز شدن ژن‏های سازنده  rBMP2و فعالیت چند مرحله‏ای ان طی تکامل مفصل⁽⁸⁾ می‏تواند نحوه پاسخ مفصل توسط rBMP2 حین جلو آوردن فک پایین را تحت تاثیر قرار دهد.

BMPs به هـمراه آنتاگونیست‏های خـود طـی تـکامل

جنینی، نقش مهمی را در تمایز و تخصصی شدن مفاصل سینوویال بازی می‏کنند. دانستن نحوه تکامل مفصل گیجگاهی-فکی جهت تعیین فاکتورها یا فرایندهای جدید مورد استفاده در استراتژی‏های درمانی ضروری است.⁽¹⁵⁾ یک استرتژی برای شکل‏گیری یا ترمیم تمایز سلول‏های غضروفی از سلول‏های تمایز نیافته مزانشیمی است.

 rBMP2 سبب تحریک روند کندروژنزیس می‏شود زیرا کندروسیت‏های ارتیکولار به سیگنال‏های rBMP2 حساسند.⁽¹⁶⁾

قابلیت فاکتورهای رشد مثل  rBMP2برای القای تشکیل استخوان یا غضروف جدید به نوع خاص هر فاکتور رشد، دوز و غلظت آن ناحیه تزریق و نوع ماده انتقال دهنده هر فاکتور بستگی دارد. یک ماده انتقال دهنده مناسب جهت رژنراسیون اپتیمال استخوان و غضروف، به دلیل تاثیری که این ماده بر تعیین ثبات دوز و فعالیت بیولوژیک سیگنال مورفوژنتیک می‏گذارد، ضروری است.

ایده‏آل‏‏ترین ماده انتقال‏دهنده نباید به بافت‏های میزبان صدمه‏ای بزند.⁽²⁰⁾ در این مطالعه از نرمال سالین به عنوان ماده انتقال دهنده استفاده شد. مزیت این ماده خنثی و استریل بودن آن است چرا که خطر انتقال بیماری از طریق آن وجود ندارد. آماده‏سازی آسان آن نیز برای کاربرد‏های کلینیکی اهمیت دارد.⁽²¹⁾

فقدان آماس و آبسه در گروه rBMP2 نشان داد که این ماده احتمالاً یک ماده مطمئن و سازگار با بافت‏های میزبان می‏باشد؛ اما اثبات این موضوع نیازمند مطالعات بیشتر است. ما هیچ تفاوت بارزی به لحاظ کلینیکی بین سمت چپ و راست مشاهده نکردیم که گویای این مطلب است که rBMP2 سبب رشد ناقرینه نمی‏شود. تفاوت مشاهده شده بین دو گروه کنترل و  rBMP2 در مورد هیپرپلازی غضروف، بر خلاف دو گروه کنترل و نرمال سالین به لحاظ شهودی بارز بود؛ که این امر دلالت بر این مسئله دارد که عامل تاثیرگذار احتمالاً وجود rBMP2 در گروه مورد بوده است نه وجود نرمال سالین یا بایت جامپر. دفورمیتی دیسک در هر سه گروه مشاهده شد که کم‏‏ترین میزان آن در گروه کنترل بود. حضور دفورمیتی دیسک در گروه کنترل، که فاقد هرگونه عوامل مداخله‏گری در ناحیه مفصل بودند، می‏تواند به دلیل مسیر نرمال رشد در خرگوش‏ها یا به دلیل نگهداری آنها در یک محیط مصنوعی و یا به علت تغذیه تعیین شده آنها از سوی پژوهشگر باشد. در مقایسه دو گروه نرمال سالین و rBMP2، میزان دفورمیتی دیسک در گروه rBMP2 کمتر بود، چرا که rBMP2 قادر به تنظیم فرایندهای تشکیلی و تحلیلی به صورت همزمان می‏باشد.⁽⁵⁾ البته ناگفته نماند که ایجاد دفورمیتی می‏تواند به دلایل بسیاری از جمله نیروی رو به جلوی دستگاه، صدمه مکانیکی تزریق وجود نرمال سالین و یا  rBMP2باشد. پیشنهاد می‏شود برای تعیین علت دقیق دفورمیتی مطالعات بیشتری صورت گیرد. عدم همکاری خرگوش‏ها تفاوت‏های فردی بین خرگوش‏ها، نحوه عملکرد پژوهشگر شرایط محل نگهداری خرگوش‏ها عدم امکان بازسازی کامل شرایط درمان در خرگوش‏ها در مقایسه با انسان‏ها مدت زمان پیگیری و نوع مفصل مورد بررسی از محدودیت‏های این مطالعه بود. بنابراین مطالعات بیشتر و برای مدت زمان بیشتری نیاز است تا بتوان به طور مطمئن از rBMP2 در درمان بیماری‏های TMJ و تحریک رشد فک پایین در دفی شنسی‏های فک پایین در انسان‏ها بهره برد.

نتیجه گیری

براساس نتایج این مطالعه، تزریق داخل مفصل گیجگاهی rBMP2 باعث افزایش فعالیت رشدی غضروف کندیلار گـردید که ایـن افزایش فـعالیت عمدتاً به شکل هیپرپلازی غضروف مشاهده گردید.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از حمایت‏های معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان و مشهد تقدیر و تشکر می‏‏گردد.