Antibacterial Effect of Green Tea Extract on Streptococcus mutans and Enterococcus faecalis Isolated from Dental Plaque

Document Type : original article

Authors

1 Pharmacist, Dept of Microbiology, Islamic Azad University, Pharmaceutical Sciences Branch, Tehran, Iran.

2 Professor, Dept of Microbiology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran.

3 ociate Professor of Prosthodontic, Oral & Maxillofacial Diseases Research center, School of Dentistry, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran

4 Instructor, Dept of Microbiology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran.

5 Professor of Phytochemistry Research Center, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, School of Pharmacetics, Tehran, Iran.

6 Statistician

Abstract

Introduction: Green tea polyphenols green tea is one important factor for inhibition of growth of oral bacteria. This study investigates the antibacterial effect of green tea extract on Enterococcus faecalis and Streptococcus mutans of dental plaques.
Materials & Methods: A lot of 60 samples of dental plaques, the samples were placed in transport medium (TSB) and were then transported to the microbiology laboratory. The samples were cultured in blood agar medium, Mitis salivarius agar, bile esculin agar and were incubated in proximity of Co2 (5-10%) at 37 °C for 48 hours. After observing the colonies, the slides were prepared and were stained by Grams Method. To ensure the authentication and identification of microorganisms, common microbial and chemical tests were used. After determining the type of bacteria, antibiogram test was done and to determine bacterial sensitivity and resistance to green tea, sodium hypochlorite and chlorhexidine by Disc Diffiusion Agar according to CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) guidelines. The data were analyzed by ANOVA and Tukey test (a=0.05)
Results: ANOVA test showed that diameter of growth inhibition of green tea was not so different from chlorhexidine for Streptococcus mutans, (P=0.305) but was significantly less than sodium hypochlorite (P=0.0001) and also the inhibitory effect of sodium hypochlorite was significantly higher than chlorhexidine (P=0.038). In Enterococcus faecalis, sodium hypochlorite was more effective than green tea and chlorhexidine (P=0.0001) and chlorhrxidine effect was significantly greater than that of green tea (P=0.0001).
Conclusion: Sodium hypochlorite had the highest inhibitory effect on growth of Streptococcus mutans and Enterococcus faecalis. Since there was no significant difference between inhibitory effect of green tea in Streptococcus mutans and chlorhexidine, using it as a mouth wash, could be a suitable alternadive way to prevent tooth decay.

Keywords


مقدمه

چای سبز که حاوی پلی‏فنول‏ها (GTPs، AmbePhytoextracts) است، یکی از سنتی‏ترین و گسترده‏ترین نوشیدنی‏ها در چین و ژاپن است که از شاخه‏های جوان گیاه Camellia sinensis به دست می‏آید. همچنین Cathechins و Flavins به عنوان مواد تشکیل‏دهنده فعال میکروبیولوژی موجود در چای سبز در نظر گرفته می‏شوند. گزارش‏هایی در حیوانات آزمایشگاهی و انسان نشان می‏دهد که مصرف چای سبز (بدون اضافه کردن شکر) باعث کاهش پوسیدگی دندان می‏شود.(3-1) مصرف مکرر چای سبز می‏تواند به میزان قابل توجهی باعث کاهش تشکیل پوسیدگی، حتی در حضور قند در رژیم غذایی شود. (GTP) Green Tea Poly phenolsموجود در چای سبز باعث مهار رشد باکتری‏های دهان و دندان مانند استرپتوکوکوس سالیواریوس و استرپتوکوکوس موتانس می‏شود. همچنین GTP مانع از رشد، تولید اسید، متابولیسم و فعالیت آنزیم Glucosyl transferees در استرپتوکوکوس موتانس و باکتری‏های پلاک دندانی می‏شود.(1) چای سبز به غیر از ترکیبات فنول, یک منبع طبیعی از فلوراید و یک ابزار موثر برای رساندن فلوراید به حفره دهان است. در نتیجه، چای سبز به عنوان یک ماده غذایی برای بهداشت دهان و دندان در نظر گرفته می‏شود و به طور گسترده‏ای در فرمولاسیون خمیر دندان استفاده می‏شود. گزارش‏ها نشان دادند پلی‏فنول‏های چای سبز باعث مهار رشداسترپتوکوکوس موتانس، استافیلوکوکوس آرئوس وE.coli می‏شود.(5و4و2)Koyamaو همکارانش(6)نشان دادند که میزان پوسیدگی دندان‏های افراد، با میزان مصرف چای سبز ارتباط دارد. Gianmaria و همکارانش(7)در مطالعه خود بیان کردند که پلی‏فنول‏های چای سبز با مهار استرپتوکوک‏های دهان باعث پیشگیری از پوسیدگی می‏شود.

بیماری‏های دهان و دندان از جمله پوسیدگی دندان، بیماری لثه و از دست دادن دندان ممکن است به طور قابل توجهی سلامت کلی فرد را تحت تاثیر قرار دهد. در این میان، پوسیدگی دندان یک بیماری پلی‏میکروبیال است که در آن، تغذیه، عفونت میکروبیولوژی و پاسخ میزبان نقش مهمی دارد. عفونت اولیه کانال ریشه موجب تجمع میکروارگانیسم‏ها در بافت پالپ نکروتیک می‏گردد.(8) عفونت اولیه کانال ریشه دندان به صورت پلی‏میکروبیال شامل باکتری‏های گرم منفی بی هوازی میله‏ای هستند و میکرو ارگانیسم‏هایی که سبب عفونت ثانویه می‏شوند از یک یا چند گونه باکتری تشکیل شده‏اند. اینترکوکوس فوکالیس یک ارگانیسم مقاوم است و با وجود اینکه بخش کوچکی از فلور کانال‏های درمان نشده را تشکیل می‏دهد اما نقش بزرگی در اتیولوژی ضایعات اطراف ریشه پس از درمان کانال ریشه دارد.(11-9) اینترکوکوس فوکالیس می‏تواند در شرایط سخت مثل تمیز کردن و پر کردن خوب کانال ریشه حتی با مواد مغذی کم زنده بماند.(11و5) تمیز کردن کامل کانال ریشه با استفاده از ابزارهای مکانیکی به دلیل آناتومی بسیار پیچیده کانال ریشه میسر نیست و برای درمان موفق، شست و شوی مناسب کانال ریشه و ضدعفونی کردن در طول درمان ریشه ضروری است.(14-12و1) با توجه به شیوع بالای پوسیدگی در کشورمان و عوارض این بیماری، پیشگیری و درمان محافظه‏کارانه این بیماری از اولویت‏های تحقیقی محسوب می‏شود. در راستای این موضوع با بررسی و مقایسه اثرات سه ماده چای سبز،هیپوکلریت سدیم و کلرهگزیدین 2/0 درصد بر فلور پوسیدگی‏زا و رمینرالیزاسیون دندانی، مسیری تازه، علمی و ارزان قیمت در پیشگیری و درمان پوسیدگی گشوده خواهد شد.

مواد و روش‏ها

پس از کسب اجازه از کمیته اخلاق به شماره نامه مصوب 7305 تست‏های آزمایشگاهی بر روی نمونه‏های بیماران انجام گرفت.

این مطالعه که به صورت تجربی انجام گرفت، ابتدا رضایت نامه کتبی از بیماران مورد آزمایش اخذ شد. جامعه مورد مطالعه شامل 60 نمونه پلاک دندانی از40 مرد و 20 زن در گروه سنی 20 تا 40 سال بود که با مراجعه مداوم به مراکز درمانی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی با سوآپ استریل از پلاک‏ها جمع آوری گردیده بود.در این تحقیق، بیماران مبتلا به بیماری‏های بدخیم و ضعف سیستم ایمنی و بیماران دیابتیک از مطالعه حذف گردیدند. نمونه‏ها پس از اخذ شدن از بیماران به محیط ترانسپورتوارد و به آزمایشگاه میکروب شناسی دانشکده پزشکی شهید بهشتی منتقل شدند. جهت رشد میکروارگانیسم‏ها و بررسی خصوصیات کلونی آنها، نمونه‏ها در محیط بلادآگار، میتیس سالیواریوس آگار و بایل اسکولین آگار کشت داده شدند و در ادامه محیط‏ها به مدت 48 ساعت در مجاورت (10-5 درصد) Co2 ودر دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردیدند. پس از مشاهده کلونی‏ها در پلیت، از آنها لام تهیه و سپس رنگ‏آمیزی گرم انجام شد. در مراحل بعدی جهت اطمینان برای تعیین هویت و شناسایی میکروارگانیسم‏ها از تست‏های میکروبی و شیمیایی معمول استفاده گردید.کلونی‏های چسبنده، تیره و صاف استرپتوکوکوس موتانس پس از 48 ساعت در محیط میتیس سالیواریوس مشاهده شدند. کلونی‏های اینترکوکوس فوکالیس در محیط بایل اسکولین آگار به دلیل هیدرولیز اسکولین باعث تغییر رنگ محیط به قهوه‏ای شدند.پس از شناسایی باکتری‏ها، حساسیت و مقاومت آنها نسبت به عصاره چای سبز (نگین نادر-شمال) و دهانشویه کلر هگزیدین 2/0 درصد (شهردارو- تهران) و هیپوکلریت سدیم (داروگر-تهران) توسط آزمایشات MIC Minimum Inhibitory Consentration)) و Disc Diffusion Agar ارزیابی شد.

ابتدا روش تلقیح میکروبی برای انجام تست آنتی‏بیوگرام به روش کربی بائر انجام گرفت، به این ترتیب که توسط یک لوپ استریل چند کلونی ایزوله از باکتری مورد نظر از محیط کشت باکتری برداشته و در 10 میلی‏متر آبگوشت حل و در گرمخانه 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد. بعد از سپری شدن 3-2 ساعت، کدورت حاصله با استفاده از مک فارلند نمره 5/0 مقایسه شد. این استاندارد تقریبا معادل 108×5/1باکتری در هر میلی‏لیتر است. غلظت تلقیح میکروبی بر روی ناحیه ممانعت از رشد مؤثر است. بعد از تلقیح میکروبی، سوسپانسیون ظرف مدت 15 دقیقه به محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده شد.

برای تهیه عصاره چای سبز، پس از تهیه برگ چای سبز، در هوای آزاد خشک و سپس توسط خرد کن به قطعات کوچکتر تقسیم شد. جهت تهیه عصاره آبی از روش عصاره‏گیری آب و تخلیص با اتیل استات استفاده گردید. بر این اساس پس از مخلوط کردن 200 گرم پودر چای سبز و 1 لیتر آب 95 درجه سانتی گراد، مخلوط حاصل به یک بشر منتقل شد و توسط هیتر با درجه حرارت 45 درجه سانتی گراد به مدت 8 ساعت عمل عصاره گیری انجام گردید. پس از جدا کردن و صاف کردن مخلوط، به منظور تخلیص ترکیبات فنولی از دیگر مواد موجود در فاز آبی، میزان cc500 اتیل استات به فاز آبی برای مدت 15 دقیقه اضافه گردید. پس از این مدت فاز اتیل استات جدا گردید و پس از حذف حلال اتیل‏استات، عصاره خشک به دست آمد.

آزمایش آنتی بیوگرام به روش AgarDisc Diffusion به این صورت بود که دیسک بلانک آغشته به عصاره چای سبز با غلظت µg/µl 100 و دیسک‏های بلانک آغشته به دهانشویه کلر هگزیدین 2/0 درصدو هیپوکلریت سدیم به مدت 1 ساعت در انکوباتور º37 قرار داده شد تا خشک شود. سپس بر روی محیط کشت مناسب که قبلاً توسط تلقیح میکروبی آغشته شده بود، در فواصل مناسب قرار داده شد. در ادامه اثر دیسک حاوی عصاره چای سبز به تنهایی یا با دیسک حاوی دهانشویه کلر هگزیدین 2/0 درصد و هیپوکلریت سدیم مقایسه شد. تحلیل داده‏ها با استفاده از آزمون کولموگروف-اسمیرنوف جهت آزمون نرمال بودن داده‏ها آنالیز واریانس یک‏طرفه میانگین به منظور مقایسه میانگین‏ها در چند گروه و آزمون تکمیلی توکی انجام شد. سطح معنی‏دار درل آزمون ها 05/0 در نظر گرفته شد.

یافته‏ ها

هیپوکلریت سدیم بیشترین اثر مهاری را روی هر دوگونه باکتریایی داشته است (جدول 1 و 3).

قدرت اثر کلرهگزیدین در برابر استرپتوکوکوس موتانس با چای سبز تفاوت معنی‏داری نداشت (305/0P=). اما بطور معنی‏داری کمتر از هیپوکلریت سدیم بود (0001/0P<). قدرت اثر هیپوکلریت سدیم بیشتراز کلرهگزیدین بود (038/0P=) (جدول 2). بر اساس (جدول 4)، در مورد اینترکوکوس فوکالیس قدرت اثر هیپوکلریت سدیم بیشتر از کلروهگزیدین (0001/0P<) و کلروهگزیدین بیشتر از چای سبز بود (0001/0P<). در آنتی بیوگرام به روش MIC،استرپتوکوکوس موتانس و Entrococcus faecalis به ترتیب در برابر رقت µg/µl 5، 12 و 50 درصد حساس بود.


 

جدول 1 : میانگین قطر هاله عدم رشد استرپتوکوکوس موتانس در دیسک آغشته به چای سبز، کلرهگزیدین و هیپوکلریت سدیم

گروه‏های آزمایشی

میانگین

انحراف معیار

چای سبز

32/19

48/6

کلر هگزیدین

50/22

67/2

هیپوکلریت سدیم

0/29

06/1

نتیجه آزمون

001/0P<

3/10F=

 

 

جدول 2 : مقایسه دو به دوی قطر هاله عدم رشد استرپتوکوک موتانس توسط آزمون توکی

گروه‏های آزمایشی

اختلاف میانگین

P.value

کلر هگزیدین با چای سبز

184/3

305/0

هیپوکلریت سدیم با کلر هگزیدین

500/6

038/0

هیپوکلریت سدیم با چای سبز

684/9

001/0<

 

 

جدول 3 : میانگین قطر هاله عدم رشد اینترکوکوس فوکالیس در دیسک آغشته به چای سبز، کلرهگزیدین وهیپوکلریت سدیم

گروه‏های آزمایشی

میانگین

انحراف معیار

چای سبز

63/13

06/2

کلر هگزیدین

5/22

67/2

هیپوکلریت سدیم

0/29

069/1

نتیجه آزمون

001/0P<

8/113F=

 

 

جدول 4 : مقایسه دو به دوی قطر هاله عدم رشد در انتروکوک فوکالیس توسط آزمون توکی

گروه‏های آزمایشی

اختلاف میانگین

انحراف معیار

کلر هگزیدین با چای سبز

875/8

001/0<

هیپوکلریت سدیم با کلر هگزیدین

500/6

001/0<

هیپوکلریت سدیم با چای سبز

375/15

001/0<

 

 


بحث

از آن جائی که ترکیبات پلی‏فنول چای سبز به عنوان ترکیب ضدباکتری معرفی شده است.(30-27و1) در این مطالعه بر آن شدیم تا اثر ضد پوسیدگی عصاره پلی‏فنول چای سبز را با کلرهگزیدین 2/0 درصد و هیپوکلریت سدیم در محیط آزمایشگاه مورد مقایسه قرار دهیم. نتایج مطالعه نشان داد بیشترین اثر مهار رشد بر استرپتوکوکوس موتانس مربوط به هیپوکلریت سدیم بود و کلرهگزیدین و چای سبز اثر مهاری معنی‏داری نشان نداد (جدول 1 و 2) که با نتایج مطالعه Sirisha Neturi(29) مطابقت دارد.

بیشترین اثر مهار رشد در اینترکوکوس فوکالیس به ترتیب مربوط به هیپوکلریت سدیم، کلرهگزیدین و چای سبز بود (جدول 3 و 4). نتایج روش MIC در هر دو سوش یکسان بود و به صورت حساسیت 50 درصد در برابر رقت µg/µl 5/12 گزارش گردید. Otake و همکارانش(15) اثر ترکیب‏های پلی‏فنلی از چای سبز ژاپنی را بر پوسیدگی دندان بررسی کردند. در این مطالعه ترکیبات پلی‏فنولیک Camellia sinensis به طور موثر باعث مهار اتصال استرپتوکوکوس موتانس به دیسک Hydroxyapatide پوشیده شده با بزاق شده بود.Kaneko و همکارانش(16) دریافتند که یک رژیم چهار هفته استفاده از دهانشویه با محلول رقیق کاتچین که از پلی‏فنول‏های چای سبز است، موجب کاهش بوی بد دهان ناشی از بیماری پریودنتال می‏شود. همچنین Yasuda(17) ثابت کردند کاتچین موجود در چای باعث بوزدایی دهان می‏شود. Pujar و همکارانش(18) اثر ضدمیکروبی Triphala پلی‏فنول چای سبز (GTP) و هیپوکلریت سدیم 3 درصد را بر علیه بیوفیلم اینترکوکوس فوکالیس در بستر دندان در شرایط in vitro مقایسه کردند. نتیجه آنالیز کمی، مهار رشد کامل باکتریایی و حداکثر اثر ضدمیکروبی در برابر بیوفیلم اینترکوکوس فوکالیس را با هیپوکلریت سدیم 3 درصد نشان داد (GTP) و Triphala(18) اثرات آنتی باکتریال بهتری را به صورت علامت‏دار نشان داد که با نتایج این مطالعه همخوانی دارد. در یک مطالعه مقطعی بر روی کودکان مدارس متوسطه در انگلستان، نوشیدن چای با سطوح پایین‏تر از پوسیدگی دندان همراه بود. Prabhakar و همکارانش(19) اثر ضدمیکروبی Triphala و پلی‏فنول‏های چای سبز، MTAD و هیپوکلریت سدیم 5 درصد علیه بیوفیلم اینترکوکوس فوکالیس تشکیل شده روی سوبسترای دندان را بررسی کردند. هیپوکلریت سدیم 5 درصد حداکثر فعالیت ضدباکتری در برابر بیوفیلم اینترکوکوس فوکالیس تشکیل شده روی سوبسترای دندان را نشان داد. در مطالعات حیوانی نشان داده‏اند که رت‏های عاری از پاتوژن خاص، آلوده به استرپتوکوکوس موتانس با یک رژیم غذایی Cariogenic حاوی GTP به طور معنی‏داری پوسیدگی دندانی کمتری داشت.(15)Carmen Cabrera همکارانش(20) پیشنهاد دادند که اثر ضدپوسیدگی پلی‏فنول‏های چای به دلیل جذب بیشتر فلوراید در اثر مصرف چای است اما با توجه به مطالعه Brando و همکارانش(21) این امر صحیح به نظر نمی‏رسد، زیرا آن‏ها ثابت کردند مصرف چای سبز نسبت به مصرف فلوراید تأثیر بیشتری در جلوگیری از پوسیدگی دندان دارد. در مطالعه Hirasawa و همکارانش(22)، مصرف موضعی پلی‏فنول‏های چای سبز در دهان سبب بهبود بیماری لثه و عفونت می‏شود. با توجه به اثرات زیان بار هیپوکلریت سدیم از جمله سمیت، بو و تغییر رنگ(23) و عوارض جانبی کلروهگزیدین که شامل Desquamations و درد در مخاط دهان و نیز تغییر رنگ که در مطالعه‏ای نشان داده شد 12 درصد از سطح دندان و 62 درصد از دندان‏های پر شده، بی رنگ شد و 36 درصد زبان افراد تغییر رنگ یافت.(24) با در نظر گرفتن اینکه استرپتوکوکوس موتانس در ایجاد پوسیدگی دندان نقش مهمی دارند و همچنین با توجه به عوارض جانبی کلرهگزیدین(23)، طبق این مطالعه چای سبز می‏تواند دهانشویه مناسبی باشد که در کنار سایر روش‏ها در پیشگیری از پوسیدگی دندان به کار رود. به هر حال مطالعات بالینی اثر ضدپوسیدگی عصاره پلی‏فنول‏های چای سبز در حجم نمونه بیشتر، غلظت‏های بالاتر عصاره پلی‏فنول و استفاده مکرر از آن در آینده برای کسب نتایج دقیق‏تر ضروری به نظر می‏رسد.

نتیجه گیری

بر اساس این مطالعه اثر مهاری چای سبز بر روی استرپتوکوکوس موتانس با کلرهگزیدین تفاوت معنی‏داری نداشت.

تشکر و قدردانی

این مقاله منتج از پایان نامه به شماره 2458 می‏باشد. بدین وسیله از مدیریت محترم گروه میکروب‏شناسی دانشکده علوم پزشکی دانشگاه شهید بهشتی به منظور همکاری در اجرای این طرح تقدیر و تشکر می‏نماییم.

  1. Zehnder M. Root canal irrigants. J Endod 2006; 32(5): 389-98.
  2. Elvin-Lewis MV, Kopjas T. Anticariogenic potential of commercial teas. J Prosthet Dent 1980; (6): 273-6.
  3. Lester A. Mitscher MJ, Delbert S, Jin-Hui D, Linda S, Segaran P. Chemoprotection: A review of the potential therapeutic antioxidant properties of green tea (Camellia sinensis) and certain of its constituents. Med Res Rev 1997; 17(4): 327-65.
  4. An BJ, Kwak JH, Son JH, Park JM, Lee JY, Jo C, et al. Biological and anti-microbial activity of irradiated green tea polyphenols. Food Chem; 88(4): 549-55.
  5. Rimondia S, Percival D, Monty S, Duggal S, Philip D. The effect of cocoa polyphenols on the growth, metabolism, and biofilm formation by Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis. Eur J Oral Sci 2006; 114(4): 343-8.
  6. Koyama Y, Kuriyama S, Aida J, Sone T, Nakaya N, Ohmori-Matsuda K, et al. Association between green tea consumption and tooth loss: Cross-sectional results from the Ohsaki Cohort 2006 Study. Prev Med 2010; 50(4): 173-9.
  7. Gianmaria F, Ferrazzano LR, Ivana A, Tiziana C, Giancarla S, Aniello I. Antimicrobial properties of green tea extract against cariogenic microflora: An in vivo study. J Med Food 2011; 14(9).
  8. Tronstad PTS. The evolving new understanding of endodontic infections. Endod Topics 2003; 6(1): 57-77.
  9. Stuart CH, Schwartz SA, Beeson TJ, Owatz CB. Enterococcus faecalis: Its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment. J Endod 2006; 32(2): 93-8.
  10. Sundqvist G, Figdor D, Persson S, Sjögren U. Microbiologic analysis of teeth with failed endodontic treatment and the outcome of conservative re-treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1998; 85(1): 86-93.
  11. Pinheiro ET, Gomes BP, Ferraz CC, Sousa EL, Teixeira FB, Souza-Filho FJ. Microorganisms from canals of root-filled teeth with periapical lesions. Int Endod J 2003; 36(1): 1-11.
  12. Peciuliene V, Reynaud AH, Balciuniene I, Haapasalo M. Isolation of yeasts and enteric bacteria in root-filled teeth with chronic apical periodontitis. Int Endod J 2001; 34(6): 429-34.
  13. Becker TD, Woollard GW. Endodontic irrigation. Gen Dent 2001; 49(3): 272-6.
  14. Markus Haapasalo UE, Homan Z, Jeffrey M. Eradication of endodontic infection by instrumentation and irrigation solutions. Endod Topics 2005; 10(1): 77-102.
  15. Otake S, Makimura M, Kuroki T, Nishihara Y, Hirasawa M. Anticaries effects of polyphenolic compounds from Japanese green tea. Cari Res 1991; 25(6): 438-43.
  16. Kaneko SN, Suzuki Y, Nakamukai M, Ikazaki R, Ishida N, Kanayasu E, et al. Anti-cariogenic properties of tea. J Med Microbiol 2001; 50: 299-302.
  17. H Yasuda TA. Deodorizing mechanism of epigallocatechin gallate against methyl mercaptan. Bio Sci Biotech Biochem 1995; 59: 1232-6.
  18. Pujar CP, Kadam A. Comparison of antimicrobial efficacy of Triphala, (GTP) Green tea polyphenols and 3% of sodium hypochlorite on Enterococcus faecalis biofilms formed on tooth substrate: In vitro. J Inter Oral Health 2011; 3(2):23-9.
  19. Prabhakar J, Senthilkumar M, Priya MS, Mahalakshmi K, Sehgal PK, Sukumaran VG. Evaluation of antimicrobial efficacy of herbal alternatives (triphala and green tea polyphenols), mtad, and 5% sodium hypochlorite against Enterococcus faecalis biofilm formed on tooth substrate: An in vitro study. J Endod 2010; 36(1): 83-6.
  20. Carmen Cabrera RA, Rafael G. Beneficial effects of green tea—a review. J Am Coll Nut 2006; 25(2): 79-99.
  21. Eloiza H da Silva Brandão LD, Fernando Landucci L, Yumi Koga-Ito C, Antonio Olavo CJ. Antimicrobial activity of coffee-based solutions and their effects on Streptococcus mutans adherence. Braz J Oral Sci 2007; 6(20): 1274-7.
  22. Hirasawa M, Takada K, Makimura M, Otake S. Improvement of periodontal status by green tea catechin using a local delivery system: A clinical pilot study. J Perio Res 2002; 37(6): 433-8.
  23. Jeansonne MJ, White RR. A comparison of 2.0% chlorhexidine gluconate and 5.25% sodium hypochlorite as antimicrobial endodontic irrigants. J Endod 1994; 20(6): 276-8.
  24. Flotra L, Gjermo P, Rolla G, Waerhaug J. Side effects of chlorhexidine mouth washes. Scand J Dent Res1971; 79(2): 119-25.
  25. GF Brooks JB, Morse SA, Jawetz M. Adelberg's Medical Microbiology. 21st ed. 2013: 203-17.
  26. Lorian V. Bailey & Scott's diagnostic microbiology. J Am Med Assoc 1990; 264(22): 327.
  27. Sakanaka S, Kim M, Taniguchi M, et al. Antibacterial substances in Japanese Green Tea extract against streptococus mutans, a cariogenic bacterium. Agric Biol Chem 1989; 53(9): 2307-11.
  28. Mankovskaia A, Celine M, Prakki A. Catechin-incorporated dental copolymers inhibit growth of streptococcus mutans. J Appl Oral Sci 2013; 21(2): 203-7.
  29. Sirisha Neturi R, Srinvas R, Vikram Simha B. Effects of green tea on Streptococcus mutans counts-A randomised control trial. J Clin Diag Res 2014; 8(11): 128-30.
  30. Lee P, Soo Tan K. Effects of epigallocatechin gallate against enterococcus faecalis biofilm and virulence. Arch Oral Biol 2015; 60 (7): 393-9.