Document Type : original article
Authors
1 Pharmacist, Dept of Microbiology, Islamic Azad University, Pharmaceutical Sciences Branch, Tehran, Iran.
2 Professor, Dept of Microbiology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran.
3 ociate Professor of Prosthodontic, Oral & Maxillofacial Diseases Research center, School of Dentistry, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran
4 Instructor, Dept of Microbiology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran.
5 Professor of Phytochemistry Research Center, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, School of Pharmacetics, Tehran, Iran.
6 Statistician
Abstract
Keywords
مقدمه
چای سبز که حاوی پلیفنولها (GTPs، AmbePhytoextracts) است، یکی از سنتیترین و گستردهترین نوشیدنیها در چین و ژاپن است که از شاخههای جوان گیاه Camellia sinensis به دست میآید. همچنین Cathechins و Flavins به عنوان مواد تشکیلدهنده فعال میکروبیولوژی موجود در چای سبز در نظر گرفته میشوند. گزارشهایی در حیوانات آزمایشگاهی و انسان نشان میدهد که مصرف چای سبز (بدون اضافه کردن شکر) باعث کاهش پوسیدگی دندان میشود.(3-1) مصرف مکرر چای سبز میتواند به میزان قابل توجهی باعث کاهش تشکیل پوسیدگی، حتی در حضور قند در رژیم غذایی شود. (GTP) Green Tea Poly phenolsموجود در چای سبز باعث مهار رشد باکتریهای دهان و دندان مانند استرپتوکوکوس سالیواریوس و استرپتوکوکوس موتانس میشود. همچنین GTP مانع از رشد، تولید اسید، متابولیسم و فعالیت آنزیم Glucosyl transferees در استرپتوکوکوس موتانس و باکتریهای پلاک دندانی میشود.(1) چای سبز به غیر از ترکیبات فنول, یک منبع طبیعی از فلوراید و یک ابزار موثر برای رساندن فلوراید به حفره دهان است. در نتیجه، چای سبز به عنوان یک ماده غذایی برای بهداشت دهان و دندان در نظر گرفته میشود و به طور گستردهای در فرمولاسیون خمیر دندان استفاده میشود. گزارشها نشان دادند پلیفنولهای چای سبز باعث مهار رشداسترپتوکوکوس موتانس، استافیلوکوکوس آرئوس وE.coli میشود.(5و4و2)Koyamaو همکارانش(6)نشان دادند که میزان پوسیدگی دندانهای افراد، با میزان مصرف چای سبز ارتباط دارد. Gianmaria و همکارانش(7)در مطالعه خود بیان کردند که پلیفنولهای چای سبز با مهار استرپتوکوکهای دهان باعث پیشگیری از پوسیدگی میشود.
بیماریهای دهان و دندان از جمله پوسیدگی دندان، بیماری لثه و از دست دادن دندان ممکن است به طور قابل توجهی سلامت کلی فرد را تحت تاثیر قرار دهد. در این میان، پوسیدگی دندان یک بیماری پلیمیکروبیال است که در آن، تغذیه، عفونت میکروبیولوژی و پاسخ میزبان نقش مهمی دارد. عفونت اولیه کانال ریشه موجب تجمع میکروارگانیسمها در بافت پالپ نکروتیک میگردد.(8) عفونت اولیه کانال ریشه دندان به صورت پلیمیکروبیال شامل باکتریهای گرم منفی بی هوازی میلهای هستند و میکرو ارگانیسمهایی که سبب عفونت ثانویه میشوند از یک یا چند گونه باکتری تشکیل شدهاند. اینترکوکوس فوکالیس یک ارگانیسم مقاوم است و با وجود اینکه بخش کوچکی از فلور کانالهای درمان نشده را تشکیل میدهد اما نقش بزرگی در اتیولوژی ضایعات اطراف ریشه پس از درمان کانال ریشه دارد.(11-9) اینترکوکوس فوکالیس میتواند در شرایط سخت مثل تمیز کردن و پر کردن خوب کانال ریشه حتی با مواد مغذی کم زنده بماند.(11و5) تمیز کردن کامل کانال ریشه با استفاده از ابزارهای مکانیکی به دلیل آناتومی بسیار پیچیده کانال ریشه میسر نیست و برای درمان موفق، شست و شوی مناسب کانال ریشه و ضدعفونی کردن در طول درمان ریشه ضروری است.(14-12و1) با توجه به شیوع بالای پوسیدگی در کشورمان و عوارض این بیماری، پیشگیری و درمان محافظهکارانه این بیماری از اولویتهای تحقیقی محسوب میشود. در راستای این موضوع با بررسی و مقایسه اثرات سه ماده چای سبز،هیپوکلریت سدیم و کلرهگزیدین 2/0 درصد بر فلور پوسیدگیزا و رمینرالیزاسیون دندانی، مسیری تازه، علمی و ارزان قیمت در پیشگیری و درمان پوسیدگی گشوده خواهد شد.
مواد و روشها
پس از کسب اجازه از کمیته اخلاق به شماره نامه مصوب 7305 تستهای آزمایشگاهی بر روی نمونههای بیماران انجام گرفت.
این مطالعه که به صورت تجربی انجام گرفت، ابتدا رضایت نامه کتبی از بیماران مورد آزمایش اخذ شد. جامعه مورد مطالعه شامل 60 نمونه پلاک دندانی از40 مرد و 20 زن در گروه سنی 20 تا 40 سال بود که با مراجعه مداوم به مراکز درمانی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی با سوآپ استریل از پلاکها جمع آوری گردیده بود.در این تحقیق، بیماران مبتلا به بیماریهای بدخیم و ضعف سیستم ایمنی و بیماران دیابتیک از مطالعه حذف گردیدند. نمونهها پس از اخذ شدن از بیماران به محیط ترانسپورتوارد و به آزمایشگاه میکروب شناسی دانشکده پزشکی شهید بهشتی منتقل شدند. جهت رشد میکروارگانیسمها و بررسی خصوصیات کلونی آنها، نمونهها در محیط بلادآگار، میتیس سالیواریوس آگار و بایل اسکولین آگار کشت داده شدند و در ادامه محیطها به مدت 48 ساعت در مجاورت (10-5 درصد) Co2 ودر دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردیدند. پس از مشاهده کلونیها در پلیت، از آنها لام تهیه و سپس رنگآمیزی گرم انجام شد. در مراحل بعدی جهت اطمینان برای تعیین هویت و شناسایی میکروارگانیسمها از تستهای میکروبی و شیمیایی معمول استفاده گردید.کلونیهای چسبنده، تیره و صاف استرپتوکوکوس موتانس پس از 48 ساعت در محیط میتیس سالیواریوس مشاهده شدند. کلونیهای اینترکوکوس فوکالیس در محیط بایل اسکولین آگار به دلیل هیدرولیز اسکولین باعث تغییر رنگ محیط به قهوهای شدند.پس از شناسایی باکتریها، حساسیت و مقاومت آنها نسبت به عصاره چای سبز (نگین نادر-شمال) و دهانشویه کلر هگزیدین 2/0 درصد (شهردارو- تهران) و هیپوکلریت سدیم (داروگر-تهران) توسط آزمایشات MIC Minimum Inhibitory Consentration)) و Disc Diffusion Agar ارزیابی شد.
ابتدا روش تلقیح میکروبی برای انجام تست آنتیبیوگرام به روش کربی بائر انجام گرفت، به این ترتیب که توسط یک لوپ استریل چند کلونی ایزوله از باکتری مورد نظر از محیط کشت باکتری برداشته و در 10 میلیمتر آبگوشت حل و در گرمخانه 37 درجه سانتی گراد قرار داده شد. بعد از سپری شدن 3-2 ساعت، کدورت حاصله با استفاده از مک فارلند نمره 5/0 مقایسه شد. این استاندارد تقریبا معادل 108×5/1باکتری در هر میلیلیتر است. غلظت تلقیح میکروبی بر روی ناحیه ممانعت از رشد مؤثر است. بعد از تلقیح میکروبی، سوسپانسیون ظرف مدت 15 دقیقه به محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده شد.
برای تهیه عصاره چای سبز، پس از تهیه برگ چای سبز، در هوای آزاد خشک و سپس توسط خرد کن به قطعات کوچکتر تقسیم شد. جهت تهیه عصاره آبی از روش عصارهگیری آب و تخلیص با اتیل استات استفاده گردید. بر این اساس پس از مخلوط کردن 200 گرم پودر چای سبز و 1 لیتر آب 95 درجه سانتی گراد، مخلوط حاصل به یک بشر منتقل شد و توسط هیتر با درجه حرارت 45 درجه سانتی گراد به مدت 8 ساعت عمل عصاره گیری انجام گردید. پس از جدا کردن و صاف کردن مخلوط، به منظور تخلیص ترکیبات فنولی از دیگر مواد موجود در فاز آبی، میزان cc500 اتیل استات به فاز آبی برای مدت 15 دقیقه اضافه گردید. پس از این مدت فاز اتیل استات جدا گردید و پس از حذف حلال اتیلاستات، عصاره خشک به دست آمد.
آزمایش آنتی بیوگرام به روش AgarDisc Diffusion به این صورت بود که دیسک بلانک آغشته به عصاره چای سبز با غلظت µg/µl 100 و دیسکهای بلانک آغشته به دهانشویه کلر هگزیدین 2/0 درصدو هیپوکلریت سدیم به مدت 1 ساعت در انکوباتور º37 قرار داده شد تا خشک شود. سپس بر روی محیط کشت مناسب که قبلاً توسط تلقیح میکروبی آغشته شده بود، در فواصل مناسب قرار داده شد. در ادامه اثر دیسک حاوی عصاره چای سبز به تنهایی یا با دیسک حاوی دهانشویه کلر هگزیدین 2/0 درصد و هیپوکلریت سدیم مقایسه شد. تحلیل دادهها با استفاده از آزمون کولموگروف-اسمیرنوف جهت آزمون نرمال بودن دادهها آنالیز واریانس یکطرفه میانگین به منظور مقایسه میانگینها در چند گروه و آزمون تکمیلی توکی انجام شد. سطح معنیدار درل آزمون ها 05/0 در نظر گرفته شد.
یافته ها
هیپوکلریت سدیم بیشترین اثر مهاری را روی هر دوگونه باکتریایی داشته است (جدول 1 و 3).
قدرت اثر کلرهگزیدین در برابر استرپتوکوکوس موتانس با چای سبز تفاوت معنیداری نداشت (305/0P=). اما بطور معنیداری کمتر از هیپوکلریت سدیم بود (0001/0P<). قدرت اثر هیپوکلریت سدیم بیشتراز کلرهگزیدین بود (038/0P=) (جدول 2). بر اساس (جدول 4)، در مورد اینترکوکوس فوکالیس قدرت اثر هیپوکلریت سدیم بیشتر از کلروهگزیدین (0001/0P<) و کلروهگزیدین بیشتر از چای سبز بود (0001/0P<). در آنتی بیوگرام به روش MIC،استرپتوکوکوس موتانس و Entrococcus faecalis به ترتیب در برابر رقت µg/µl 5، 12 و 50 درصد حساس بود.
جدول 1 : میانگین قطر هاله عدم رشد استرپتوکوکوس موتانس در دیسک آغشته به چای سبز، کلرهگزیدین و هیپوکلریت سدیم
گروههای آزمایشی |
میانگین |
انحراف معیار |
چای سبز |
32/19 |
48/6 |
کلر هگزیدین |
50/22 |
67/2 |
هیپوکلریت سدیم |
0/29 |
06/1 |
نتیجه آزمون |
001/0P< |
3/10F= |
جدول 2 : مقایسه دو به دوی قطر هاله عدم رشد استرپتوکوک موتانس توسط آزمون توکی
گروههای آزمایشی |
اختلاف میانگین |
P.value |
کلر هگزیدین با چای سبز |
184/3 |
305/0 |
هیپوکلریت سدیم با کلر هگزیدین |
500/6 |
038/0 |
هیپوکلریت سدیم با چای سبز |
684/9 |
001/0< |
جدول 3 : میانگین قطر هاله عدم رشد اینترکوکوس فوکالیس در دیسک آغشته به چای سبز، کلرهگزیدین وهیپوکلریت سدیم
گروههای آزمایشی |
میانگین |
انحراف معیار |
چای سبز |
63/13 |
06/2 |
کلر هگزیدین |
5/22 |
67/2 |
هیپوکلریت سدیم |
0/29 |
069/1 |
نتیجه آزمون |
001/0P< |
8/113F= |
جدول 4 : مقایسه دو به دوی قطر هاله عدم رشد در انتروکوک فوکالیس توسط آزمون توکی
گروههای آزمایشی |
اختلاف میانگین |
انحراف معیار |
کلر هگزیدین با چای سبز |
875/8 |
001/0< |
هیپوکلریت سدیم با کلر هگزیدین |
500/6 |
001/0< |
هیپوکلریت سدیم با چای سبز |
375/15 |
001/0< |
بحث
از آن جائی که ترکیبات پلیفنول چای سبز به عنوان ترکیب ضدباکتری معرفی شده است.(30-27و1) در این مطالعه بر آن شدیم تا اثر ضد پوسیدگی عصاره پلیفنول چای سبز را با کلرهگزیدین 2/0 درصد و هیپوکلریت سدیم در محیط آزمایشگاه مورد مقایسه قرار دهیم. نتایج مطالعه نشان داد بیشترین اثر مهار رشد بر استرپتوکوکوس موتانس مربوط به هیپوکلریت سدیم بود و کلرهگزیدین و چای سبز اثر مهاری معنیداری نشان نداد (جدول 1 و 2) که با نتایج مطالعه Sirisha Neturi(29) مطابقت دارد.
بیشترین اثر مهار رشد در اینترکوکوس فوکالیس به ترتیب مربوط به هیپوکلریت سدیم، کلرهگزیدین و چای سبز بود (جدول 3 و 4). نتایج روش MIC در هر دو سوش یکسان بود و به صورت حساسیت 50 درصد در برابر رقت µg/µl 5/12 گزارش گردید. Otake و همکارانش(15) اثر ترکیبهای پلیفنلی از چای سبز ژاپنی را بر پوسیدگی دندان بررسی کردند. در این مطالعه ترکیبات پلیفنولیک Camellia sinensis به طور موثر باعث مهار اتصال استرپتوکوکوس موتانس به دیسک Hydroxyapatide پوشیده شده با بزاق شده بود.Kaneko و همکارانش(16) دریافتند که یک رژیم چهار هفته استفاده از دهانشویه با محلول رقیق کاتچین که از پلیفنولهای چای سبز است، موجب کاهش بوی بد دهان ناشی از بیماری پریودنتال میشود. همچنین Yasuda(17) ثابت کردند کاتچین موجود در چای باعث بوزدایی دهان میشود. Pujar و همکارانش(18) اثر ضدمیکروبی Triphala پلیفنول چای سبز (GTP) و هیپوکلریت سدیم 3 درصد را بر علیه بیوفیلم اینترکوکوس فوکالیس در بستر دندان در شرایط in vitro مقایسه کردند. نتیجه آنالیز کمی، مهار رشد کامل باکتریایی و حداکثر اثر ضدمیکروبی در برابر بیوفیلم اینترکوکوس فوکالیس را با هیپوکلریت سدیم 3 درصد نشان داد (GTP) و Triphala(18) اثرات آنتی باکتریال بهتری را به صورت علامتدار نشان داد که با نتایج این مطالعه همخوانی دارد. در یک مطالعه مقطعی بر روی کودکان مدارس متوسطه در انگلستان، نوشیدن چای با سطوح پایینتر از پوسیدگی دندان همراه بود. Prabhakar و همکارانش(19) اثر ضدمیکروبی Triphala و پلیفنولهای چای سبز، MTAD و هیپوکلریت سدیم 5 درصد علیه بیوفیلم اینترکوکوس فوکالیس تشکیل شده روی سوبسترای دندان را بررسی کردند. هیپوکلریت سدیم 5 درصد حداکثر فعالیت ضدباکتری در برابر بیوفیلم اینترکوکوس فوکالیس تشکیل شده روی سوبسترای دندان را نشان داد. در مطالعات حیوانی نشان دادهاند که رتهای عاری از پاتوژن خاص، آلوده به استرپتوکوکوس موتانس با یک رژیم غذایی Cariogenic حاوی GTP به طور معنیداری پوسیدگی دندانی کمتری داشت.(15)Carmen Cabrera همکارانش(20) پیشنهاد دادند که اثر ضدپوسیدگی پلیفنولهای چای به دلیل جذب بیشتر فلوراید در اثر مصرف چای است اما با توجه به مطالعه Brando و همکارانش(21) این امر صحیح به نظر نمیرسد، زیرا آنها ثابت کردند مصرف چای سبز نسبت به مصرف فلوراید تأثیر بیشتری در جلوگیری از پوسیدگی دندان دارد. در مطالعه Hirasawa و همکارانش(22)، مصرف موضعی پلیفنولهای چای سبز در دهان سبب بهبود بیماری لثه و عفونت میشود. با توجه به اثرات زیان بار هیپوکلریت سدیم از جمله سمیت، بو و تغییر رنگ(23) و عوارض جانبی کلروهگزیدین که شامل Desquamations و درد در مخاط دهان و نیز تغییر رنگ که در مطالعهای نشان داده شد 12 درصد از سطح دندان و 62 درصد از دندانهای پر شده، بی رنگ شد و 36 درصد زبان افراد تغییر رنگ یافت.(24) با در نظر گرفتن اینکه استرپتوکوکوس موتانس در ایجاد پوسیدگی دندان نقش مهمی دارند و همچنین با توجه به عوارض جانبی کلرهگزیدین(23)، طبق این مطالعه چای سبز میتواند دهانشویه مناسبی باشد که در کنار سایر روشها در پیشگیری از پوسیدگی دندان به کار رود. به هر حال مطالعات بالینی اثر ضدپوسیدگی عصاره پلیفنولهای چای سبز در حجم نمونه بیشتر، غلظتهای بالاتر عصاره پلیفنول و استفاده مکرر از آن در آینده برای کسب نتایج دقیقتر ضروری به نظر میرسد.
نتیجه گیری
بر اساس این مطالعه اثر مهاری چای سبز بر روی استرپتوکوکوس موتانس با کلرهگزیدین تفاوت معنیداری نداشت.
تشکر و قدردانی
این مقاله منتج از پایان نامه به شماره 2458 میباشد. بدین وسیله از مدیریت محترم گروه میکروبشناسی دانشکده علوم پزشکی دانشگاه شهید بهشتی به منظور همکاری در اجرای این طرح تقدیر و تشکر مینماییم.