Document Type : original article
Authors
1 Assistant Professor, Dept of Pediatric Dentistry, School of Dentistry, Rafsanjan University of Medical Sciences, Rafsanjan, Iran
2 Assistant Professor, Dept of Pathology, School of Medicine, Rafsanjan University of Medical Sciences, Rafsanjan, Iran
3 Assistant Professor of Social Medicine, Occupational Environment Research Center, School of Medicine, Rafsanjan University of Medical Sciences, Rafsanjan, Iran
4 Undergraduate Student of Dentistry, Rafsanjan University of Medical Sciences, Rafsanjan, Iran
Abstract
Keywords
مقدمه
خارج کردن دندان‌ها یک زخم باز در بافت نرم و استخوان برجای می‌گذارد.(1) فرآیند ترمیم زخم به چهار فاز ایجاد لخته، التهاب، تکثیر و بازسازی تقسیم می‌شود.(2) پاسخ التهابی حاد بافت لثه‌ای طی 24 تا 48 ساعت اول پس از کشیدن دندان، باعث نفوذ گلبول‌های سفید چندهسته‌ای به محل التهاب می‌شود. در فاز التهاب، نوتروفیل‌ها جهت از بین بردن باکتری‌ها، رادیکال‌های آزاد ترشح می‌کنند. رادیکال‌های آزاد، مولکول‌هایی هستند که در لایه ظرفیتشان یک الکترون جفت نشده دارند و بسیار واکنشپذیرند.(3) مشاهده شده است استرس اکسیداتیو که ناشی از برهم خوردن تعادل بین ایجاد رادیکال‌های آزاد و خنثی شدن آنها توسط آنزیم‌های آنتیاکسیدانی تولید شده توسط سلول‌ها و بافت‌های بدن است، منجر به تخریب بافتی و تأخیر در بهبود زخم می شود.(6-4) Cutandoو همکاران(3) طی مطالعهای نشان دادند استفاده موضعی ملاتونین در حفره آلوئولار سگ، استرس اکسیداتیو ناشی از کشیدن دندان را کاهش میدهد. Yoneda و همکاران(7) در مطالعهای اثر استفاده موضعی یک ماده آنتیاکسیدان (کوآنزیم Q10) را بر ترمیم بافت نرم بعد از کشیدن دندان در رت بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که استفاده موضعی از کوآنزیم Q10 باعث بهبودی سریعتر بافت نرم حفره می‌شود ولی یک اثر بازدارنده بر ریمادلینگ استخوانی دارد.
TBHQ (t-butyl hydroquinone) آنتیاکسیدانی است که تأثیر آن در کاهش استرس اکسیداتیو نشان داده شده است و به عنوان استاندارد طلایی آنتیاکسیدانها مطرح شده ودر مواد غذایی استفاده می‌شود.(9-8) این آنتیاکسیدان احتمالاً با القاء تولید تعداد زیادی آنزیم‌های محافظ سلولی و خنثیکننده سم مثل آپوکسید هیدرولاز، گلوتاتیون-s-ترانسفراز و گلوکورونیل ترانسفراز، از سلول‌ها در مقابل سمیت حاد و استرس اکسیداتیو محافظت می‌کند.(10)
از آن جایی که تاکنون اثر TBHQ بر ترمیم حفره دندان بررسی نشده است و همچنین از آن جایی که این ماده استاندارد طلایی (Gold standard) آنتیاکسیدانهای مصرفی مورد استفاده در مقالات می‌باشد، مطالعه حاضر با هدف بررسی اثر TBHQ بر ترمیم حفره دندانی بعد از کشیدن دندان در موش صحرایی انجام شد.
مواد و روش‌ها
جهت انجام این مطالعه تجربی، تعداد 42 موش نر 2-1 ساله از نژاد Wistar با جثه و وزن یکسان (محدوده وزنی 180-120 گرم) در قفس‌های انفرادی و در شرایط استاندارد در بخش فیزیولوژی دانشکده پزشکی رفسنجان نگهداری شدند. حیوانات پیش از شروع کار، جهت ارزیابی سلامت عمومی و شرایط لازم برای جراحی توسط دامپزشک معاینه شدند. سپس با تزریق داخل صفاقی ترکیب داروی بیهوشی کتامین mg/ml 100 (ایران دارو، تهران، ایران) و زایلازین mg/ml100 (ایران دارو) به نسبت 1:1 و به میزان ml/100g 1/0 تحت بیهوشی عمومی قرار گرفتند.(11)
یک دندان مولر دوم ماگزیلا در هر حیوان کشیده شد و در نیمی از حیوانات (گروه تجربی) در ساکت دندان کشیده شده، توسط سرنگ انسولین حدود 1/0 میلی لیتر محلول 02/0% TBHQ (Sigma, MO, USA) قرار داده شد ( mg02/0 پودر TBHQ در 100 میلیلیتر آب مقطر حل شد). در گروه کنترل (21 عدد موش) از هیچ ماده‌ای استفاده نشد.
جهت باقی ماندن ترکیب در ساکت، حیوانات در زمان بیهوشی حدود چهار ساعت در حالت سوپاین قرار گرفتند.(11) پس از به هوش آمدن، حیوانات در قفس‌های مجزا با دسترسی آزاد به غذا و آب و با در نظر گرفتن روز جراحی به عنوان روز صفر نگهداری شدند.
در هر یک از روزهای سوم، هفتم و بیست و یکم پس از جراحی، هفت موش از هر گروه (تجربی و کنترل) Sacrifice شد. سر موش‌ها توسط گیوتین جدا شد و به مدت یک هفته در محلول فرمالین 10% (دکتر مجللی، تهران، ایران) قرار داده شد و پس از یک هفته از فرمالین خارج و در محلول اتیلندیآمینتترااستیکاسید 4% (EDTA)(Merck, Berlin, Germany) جهت دکلسیفیکاسیون بافت استخوانی قرار گرفت.(11)
پس از نرم شدن بافت استخوانی، پاساژ بافتی با دستگاهTissue processor (Sukura fine technical, Tokyo, Japan) انجام گرفت. سپس در طول محور ساجیتال، برش‌های پنج میکرونی با میکروتوم (SIEE medial, Mainz, Germany) زده شده و رنگ‌آمیزی به روش هماتوکسیلین- ائوزین انجام شد.(11) برش بافتی از ساکت ریشه دیستال و از قسمت میانی انجام شد.(11)
متغیرهایی که جهت ارزیابی ترمیم بررسی گردید وسعت بافت گرانولاسیون، وسعت ترابکول‌های استخوانی، شمارش سلولهای التهابی، تعداد فیبروبلاست‌ها و آنژیوژنز بود. برای شمارش سلولهای التهابی نوتروفیل، لنفوسیت، ماکروفاژ و سلولهای فیبروبلاست حداقل در پنج ناحیه مختلف تعداد سلولهای مورد نظر در بزرگنمایی 400 شمارش شد و سپس میانگین سلول‌ها در این پنج فیلد محاسبه و برای آنالیز آماری ثبت شد. تعداد عروق خونی نیز در ده فیلد میکروسکوپی با بزرگنمایی 400 شمارش شد و سپس میانگین آنها محاسبه و برای آنالیز آماری ثبت گردید.(11و7و5)
دادهها پس از جمعآوری توسط نرمافزار آماریSPSS با ویرایش 18 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. دادههای کمی به صورت «انحراف معیار±میانگین» و «دامنه تغییرات» گزارش شد. به منظور مقایسه میانگین متغیرهای هیستوپاتولوژی (لنفوسیت، ماکروفاژ، نوتروفیل، فیبروبلاست، تعداد عروق تازه تشکیل شده، وسعت بافت گرانولاسیون و ترابکول‌های استخوانی تازه تشکیل شده) در هر یک از روزهای 3، 7 و 21 در دو گروه از آزمون t مستقل (Independent two-sample t-test) استفاده گردید. سطح معنیداری در آزمونها 05/0 در نظر گرفته شد.
یافته‌ها
همانگونه که در جدول 1 مشاهده می‌شود، در روز سوم، آزمون آماریt مستقل نشان داد میانگین وسعت بافت گرانولاسیون (میلیمتر مربع) در گروه TBHQ به طور معنیداری بیش از گروه کنترل می‌باشد (003/0=P). میانگین سایر متغیرهای هیستوپاتولوژی در روز سوم در دو گروه مورد بررسی از نظر آماری اختلاف معنیداری نداشت (05/0<P) ( تصویر 1 و جدول 1).
همانگونه که در جدول 2 دیده می‌شود، در روز هفتم، آزمون آماری t مستقل اختلاف معنیداری در میانگین متغیرهای هیستوپاتولوژیک در دو گروه مورد بررسی نشان نداد(05/0<P). ( تصویر2)
جدول 1 : مقایسه میانگین متغیرهای هیستوپاتولوژیک در دو گروه مورد بررسی در روز سوم
|
متغیرهای هیستوپا تولوژی |
TBHQ (7=n) انحراف معیار±میانگین (دامنه تغییرات) |
کنترل (7=n) انحراف معیار±میانگین (دامنه تغییرات) |
P-value |
|
تعداد عروق تازه تشکیل شده |
16/2 ± 00/9 |
83/1±00/7 |
086/0 |
|
نوتروفیل (درصد) |
53/5 ± 71/14 |
22/4 ± 14/16 |
597/0 |
|
لنفوسیت (درصد) |
31/2 ± 00/9 |
27/3 ± 00/9 |
999/0 |
|
ماکروفاژ (درصد) |
12/7 ± 00/48 |
68/1 ± 14/44 |
208/0 |
|
فیبروبلاست (درصد) |
29/6 ± 29/28 |
89/4 ± 71/30 |
436/0 |
|
وسعت بافت گرانولاسیون (میلیمتر مربع) |
13/0 ± 74/1 |
25/0 ± 36/1 |
003/0 |
نوع آزمون آماری t مستقل
الف) گروه TBHQ ب) گروه کنترل
تصویر 1 : برش هیستولوژیک ساکت دندانی سه روز بعد از خارج کردن دندان. الف) گروه TBHQ ب) گروه کنترل
جدول 2 : مقایسه میانگین متغیرهای هیستوپاتولوژیک در دو گروه مورد بررسی در روز هفتم
|
متغیرهای هیستوپاتولوژی |
TBHQ (7=n) انحراف معیار±میانگین (دامنه تغییرات) |
کنترل (7=n) انحراف معیار±میانگین (دامنه تغییرات) |
P-value |
|
تعداد عروق تازه تشکیل شده |
27/1 ± 43/7 |
11/1 ± 29/6 |
099/0 |
|
نوتروفیل (درصد) |
81/2 ± 71/11 |
94/2 ± 00/15 |
054/0 |
|
لنفوسیت (درصد) |
51/1 ± 57/4 |
16/1 ± 00/5 |
562/0 |
|
ماکروفاژ (درصد) |
58/5 ± 86/35 |
31/4 ± 29/33 |
354/0 |
|
فیبروبلاست (درصد) |
18/6 ± 86/47 |
07/4 ± 71/46 |
690/0 |
|
وسعت بافت گرانولاسیون (میلیمتر مربع) |
11/0 ± 80/0 |
10/0 ± 70/0 |
099/0 |
|
تشکیل ترابکول استخوانی (میلیمتر مربع) |
13/0 ± 86/0 |
13/0 ± 82/0 |
601/0 |
نوع آزمون آماری t مستقل
همانگونه که در جدول 3 دیده می‌شود، در روز بیست و یکم آزمون آماری t مستقل نشان داد میانگین نوتروفیل در گروه TBHQ به طور معنیداری کمتر از گروه کنترل بود (030/0=P). میانگین وسعت ترابکولاسیون استخوانی به طور معنیداری در گروهTBHQ بیشتر از گروه کنترل بود (001/0>P). میانگین سایر متغیرهای هیستوپاتولوژیک در روز بیست و یکم در دو گروه مورد بررسی از نظر آماری اختلاف معنیداری نشان نداد (05/0<P). ( تصویر 3 و جدول 3)
الف) گروه TBHQ ب) گروه کنترل
تصویر 2-3 : برش هیستولوژیک ساکت دندانی هفت روز بعد از خارج کردن دندان. الف)گروه TBHQب) گروه کنترل
جدول 3 : مقایسه میانگین متغیرهای هیستوپاتولوژیک در دو گروه مورد بررسی در روز بیست و یکم
|
متغیرهای هیستوپاتولوژی |
TBHQ (7=n) انحراف معیار±میانگین (دامنه تغییرات) |
کنترل (7=n) انحراف معیار±میانگین (دامنه تغییرات) |
P-value |
|
تعداد عروق تازه تشکیل شده |
76/0 ± 71/2 |
98/0 ± 57/3 |
091/0 |
|
نوتروفیل (درصد) |
11/1 ± 71/3 |
82/0 ± 00/5 |
030/0 |
|
لنفوسیت (درصد) |
53/1 ± 00/5 |
57/1 ± 14/5 |
866/0 |
|
ماکروفاژ (درصد) |
39/4 ± 29/27 |
40/5 ± 14/31 |
168/0 |
|
فیبروبلاست (درصد) |
57/5 ± 00/64 |
62/5 ± 71/58 |
102/0 |
|
وسعت بافت گرانولاسیون (میلیمتر مربع) |
07/0 ± 32/0 |
06/0 ± 40/0 |
062/0 |
|
تشکیل ترابکول استخوانی (میلیمتر مربع) |
10/0 ± 89/2 |
21/0 ± 42/2 |
001/0< |
نوع آزمون آماری t مستقل
الف) گروه TBHQ ب) گروه کنترل
تصویر 3 : ترابکول‌های استخوانی تازه تشکیل شده، 21 روز بعد از خارج کردن دندان. الف) گروه TBHQ. قسمت اعظم بافت گرانولاسیون با ترابکول‌های استخوانی تازه تشکیل شده جایگزین شده است. ب) گروه کنترل. ترابکول‌های استخوانی تازه تشکیل شده، وسعت اندکی دارد.
بحث
در فرآیند ترمیم زخم، تولید انواع اکسیژن واکنشی (Reactive Oxygen Species; ROS) جهت دفاع در مقابل پاتوژنها ضروری می‌باشد.(13و12) با این وجود قرار گرفتن در مقابل ROSمی‌تواند باعث القاء استرس اکسیداتیو و تأخیر در فرایند ترمیم زخم شود.(14) بنابراین به نظر میرسد بهبود وضعیت استرس اکسیداتیو از طریق آنتیاکسیدانها فرآیند ترمیم را تسریع کند. تاکنون مطالعهای درخصوص اثرات TBHQبر ترمیم زخم پس از خارج کردن دندان انجام نشده است و مطالعه مشابهی موجود نمیباشد. بنابراین یافتههای مطالعه حاضر با یافتههای مطالعاتی که اثر TBHQرا بر بهبود زخم‌های پوستی بررسی نمودهاند و یا مطالعاتی که اثر سایر مواد آنتیاکسیدان را بر ترمیم پس از خارج کردن دندان مورد بررسی قرار دادهاند، مقایسه میگردد.
در این مطالعه روزهای سوم، هفتم و بیست و یکم جهت بررسی فازهای اولیه، میانی و انتهایی ترمیم انتخاب گردید و در اکثر مقالات مشابه نیز، بررسی پاتولوژی در همین روزها انجام شده است.(16و11) در مطالعه حاضر افزایش بافت گرانولاسیون در روز سوم در گروه تجربی نسبت به گروه کنترل از لحاظ آماری معنیدار بود. این مسئله می‌تواند نشاندهنده تسریع ترمیم زخم در حضور TBHQباشد. مطالعه Jelenko و همکاران(15) نیز تسریع ترمیم زخم‌های پوستی ناشی از سوختگی را در حضور TBHQنشان داد. یافتههای این مطالعه با مطالعه Yonedaو همکاران(7) نیز همخوانی دارد. در مطالعه آنان نیز افزایش بافت گرانولاسیون در حضور ماده آنتیاکسیدان (کوآنزیم Q10) در حفره دندان در روز سوم مشاهده شد.
همچنین در مطالعه حاضر وسعت ترابکولاسیون استخوانی در روز بیست و یکم در گروه TBHQبه طور معنیداری بیشتر از گروه کنترل بود. این نتیجه می‌تواند نشاندهنده ترمیم سریعتر بافت سخت در حضور TBHQ باشد. Yoneda و همکاران(7) به این نتیجه رسیدند که آنتیاکسیدان Q10 در ترمیم بافت نرم مؤثرتر از بافت سخت است. علت اختلاف در نتیجه مطالعه حاضر با مطالعه Yoneda احتمالاً تفاوت در نوع ماده آنتیاکسیدان مورد بررسی می‌باشد.
در این مطالعه کاهش نوتروفیل‌ها در روز سوم در گروه مورد بررسی در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد؛ هرچند این تفاوت از نظر آماری معنیدار نبود اما کاهش تعداد این سلول‌ها در روزهای اولیه، نشاندهنده کاهش فاز التهاب و پیشرفت سیر طبیعی ترمیم زخم می‌باشد. در مطالعه Yoneda(7) نیز کاهش نوتروفیل‌ها در حضور آنتیاکسیدان در روز سوم مشاهده شد.
ماکروفاژها در روز سوم اکثریت سلولهای زخم را تشکیل میدهند. این سلول‌ها با سنتز لاکتات باعث تحریک تکثیر فیبروبلاست‌ها میشوند و به تدریج در طی فرآیند ترمیم، با جایگزین شدن فیبروبلاست‌ها به جای این سلول‌ها به مرور کاهش مییابند.(16) در این مطالعه نیز ماکروفاژها در روز سوم بیشترین تعداد سلولهای حاضر بودند. در روز سوم مطالعه، میزان رگزایی در گروه TBHQ بیشتر از گروه کنترل بود؛ هرچند این اختلاف از لحاظ آماری معنیدار نبود اما می‌تواند روند طبیعی ترمیم بافت در حضور TBHQ را نشان دهد. در روز هفتم مطالعه نیز کاهش نوتروفیل‌ها و افزایش تعداد فیبروبلاست‌ها در گروه TBHQ در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد اما این اختلاف معنیدار نبود
شاید بتوان علت معنیدار نبودن بسیاری از یافتههای این مطالعه را حجم و غلظت پایین TBHQ در حفره دندان دانست. به دلیل افزایش هزینه طرح، امکان تعیین حداکثر غلظت TBHQ بدون اثرات سمی بر بافت‌های دهان قبل از انجام مطالعه نبود و از آن جایی که تاکنون هیچ مطالعهای در خصوص اثر این ماده بر ترمیم حفره دندان انجام نشده است، غلظت مورد استفاده در این مطالعه، حداکثر غلظت قابل قبول TBHQ در صنایع غذایی بود. با این وجود شاید بتوان با افزایش غلظت این ماده تا حدی که اثرات سمی بر بافت‌های بدن نداشته باشد، روند بهبود زخم در حفره دندان را بهبود بخشید.
از محدودیت‌های مطالعه حاضر می‌‌توان به عدم استفاده از نرم افزار KS300 جهت ارزیابی معیارهای پاتولوژی اشاره نمود. به دلیل عدم دسترسی به این نرمافزار، اندازه گیریهای پاتولوژی با توجه به مقالات مشابه 11و7و5 و با کمک میکرومتر چشمی انجام گرفت.
نتیجه‌گیری
با در نظر گرفتن محدودیت‌های یک مطالعه تجربی، شاید بتوان گفت TBHQ می‌تواند باعث بهبود ترمیم بافت سخت حفره دندان شود.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله از زحمات معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی رفسنجان جهت تأمین هزینه‌های این طرح تقدیر و تشکر به عمل میآید. ضمناً این مقاله، منتج از پایان نامه با شماره 464 است که در کتابخانه دانشکده دندانپزشکی رفسنجان در دسترس می باشد.
)