Document Type : original article
Authors
1 Ph.D. Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine and Traditional Medicine Clinical Trail Research Center, Shahed University, Tehran, Iran.
2 Ph.D. Oral and Maxillofacial Pathology Department, Faculty of Dentistry, Shahed University, Tehran, Iran
3 Ph.D. Faculty of Veterinary Medicine, Amol University of Special Modern Technologies, Amol, Iran.
4 Ph.D. Department of Social Medicine and Health, Faculty of Medicine, Shahed University, Tehran, Iran.
5 Ph.D. Dentist, Behbahan University of Medical Sciences, Behbahan, Iran.
Abstract
Keywords
مقدمه
کاندیدیازیس یک بیماری مهم و شایع قارچی مخاط دهان است که توسط گونههای مختلف کاندیدا ایجاد میشود. برفک یا تراش (Thrush) شایعترین شکل کاندیدیازیس است که با افزایش رشد و تکثیر گونههای مختلف کاندیدا نظیر کاندیداآلبیکنس در دهان آغاز میشود. کاندیداآلبیکنس به اشکال مختلفی همچون مخمری، هایف کاذب و هایف حقیقی وجود دارند و قادرند در دامنهی pH بین 2 تا 8 و در شرایط بیهوازی، کمهوازی و حتی هوازی تکثیر یابند. گونههای کاندیدا قسمتی از فلور طبیعی دهان (50-25 درصد) افراد سالم را تشکیل میدهند. در بیماران بستری، فراوانی گونههای کاندیدا در دهان بیشتر از این مقدار میباشد. این میزان حتی در حالتهای خاص نظیر بیماران مبتلا به ایدز، استفاده از دندانهای مصنوعی، بیماران مبتلا به دیابت، شیمی درمانی، بدخیمیها و کودکان بیشتر نیز میباشد.(1) در مطالعهای در سال 1382 بر روی 318 بیمار، میزان شیوع کاندیدیازیس دهانی حدود 4/21 درصد گزارش شد.(2) یک تحقیق در سال 1389 بر روی افراد مبتلا به ایدز انجام گرفت و میزان شیوع کاندیدیازیس دهانی 59 درصد اعلام شد.(3) در یک مطالعهی دیگر، میزان شیوع کاندیدیازیس دهانی در بیمارن مبتلا به دیابت 3/58 درصد گزارش شد.(4) به طور کلی، حدود 90 تا 100 درصد از عفونتهای مخاطی و 50 تا 70 درصد از عفونتهای خونی ناشی از کاندیداآلبیکنس است.(5)
افزایش مقاومت کاندیداآلبیکنس به داروهای ضدقارچی استاندارد سبب گردید تا به گیاهان دارویی به عنوان ترکیبات طبیعی توجه خاصی شود. چای سبز (Camellia sinensis) یک نوشیدنی قدیمی با قدمت 5000 ساله است. چای سبز حاوی ترکیبات پلیفنول بالا با خواص آنتیاکسیدانی، ضدباکتریایی و ضدسرطانی میباشد. همچنین چای سبز مانع از پوسیدگی دندان میگردد.(8-6) گیاه بادَرَنجبویه یا بادَرَنگْبویه یا وارَنگبو (Melissa officinalis)گیاهی است از تیره نعنائیان (Lamiaceae)که دارای یک مادهی تلخ، تانن، کامفر، قندهای مختلف، مواد رزینی، مواد پکتیکی و 1/0 تا 25/0 درصد (گاهی تا 75/0 درصد) اسانس است که مادهی مؤثرهی آن به حساب میآید.(9) زیرهی سبز (Cuminum cyminum) گیاهی است از خانوادهی جعفری که قسمت مورد استفادهی این گیاه میوهی آن است. زیرهی سبز دارای صفاتی شبیه زیرهی سیاه و انیس است. میوهی این گیاه دارای تانن، 7 درصد روغن، 13 درصد رزین، آلورون و اسانسی معادل 5/2 تا 4 درصد میباشد.(9) چای سبز و بادرنجبویه گیاهانی هستند که از پوسیدگی دندان جلوگیری میکنند و جهت خوشبو کردن و ضدعفونی نمودن دهان به کار میروند. از طرفی در متون طب جدید از اثرات ضدباکتریایی و ضدقارچی این گیاهان سخن به میان آمده است. لذا در تحقیق حاضر استفاده از این گیاهان همراه با زیرهی سبز به عنوان یک ترکیب پیشنهادی برای ساخت دهانشویهی مرکب مورد بررسی آزمایشگاهی قرار گرفت.(12-9)
مواد و روشها
روش تهیهی اسانس روغنی زیرهی سبز به روش تقطیر با آب (Hydrodistillation): مقدار 100 گرم از دانههای خشک زیرهی سبز با استفاده از آسیاب برقی خرد شدند. دانههای پودر شده به داخل بالن ژوژه دستگاه اسانسگیری (کلونجر مدل دارونامه بریتانیا) ریخته شدند و به آن 700 میلیلیتر آب مقطر اضافه گردید. جریان آب سرد مبرد برقرار گشته و بالن ژوژه درون هیتر برقی دستگاه جا گرفت و دستگاه روشن شد. بعد از جوش آمدن، درجه حرارت هیتر برقی به گونهای تنظیم شد که جوشیدن شدید موجب انتقال آب و تفاله گیاه به داخل لوله دستگاه اسانسگیری نشود و دهانهی بالن ژوژه مسدود نگردد تا مانع از جریان آسان بخار آب به داخل مبرد دستگاه نشود. مقدار کمی آب مقطر به داخل بورت جمع کنندهی عرق و اسانس ریخته شد، به طوریکه اسانس فقط در ستون عمودی و در قسمت بالای انشعاب V شکل جمع گردید. اجازه داده شد که مدت دو ساعت جریان تقطیر انجام شود. بعد از دو ساعت، هیتر دستگاه خاموش و حجم اسانس جمع شده با کمک درجات روی بورت دستگاه، مشخص و یادداشت شد. سپس به ملایمت شیر خروجی بورت باز شد. ابتدا عرق گیاه در یک شیشه رنگی جمعآوری و بعد از آن اسانس گیاه در شیشه رنگی جداگانه جمع آوری گردید. درپوش شیشه محتوی اسانس با استفاده از پارافین مسدود و تا زمان استفاده داخل یخچال قرار داده شد.(13)
روش تهیهی عصارههای آبی چای سبز و بادرنجبویه: میزان لازم از گیاهان (100 گرم) آسیاب شدند و به آن 400 میلیلیتر آب مقطر اضافه گردید. نمونهها روی حرارت ملایم قرار داده شدند و دائماً محلول مخلوط شدند تا اولین نشانههای جوشیدن آشکار شد. در این حالت محلولها از روی حرارت برداشت شده و فوراً باکاغذ صافی واتمن 42 صاف گردیدند. محلولهای صاف شده جهت آبگیری به بنماری 60- 50 درجه سانتیگراد انتقال یافتند تا حالت ژلهای (نیمه جامد) در عصارهها ایجاد شوند. سپس عصارهها در حلال مناسب (آب مقطر استریل) حل گردیدند و تا زمان استفاده داخل یخچال قرار داده شدند.(14)
گروههای مختلف دهانشویههای مرکب گیاهی: در این مطالعه، 5 گروه مختلف از دهانشویههای مرکب برای آزمایش حساسیت ضدقارچی تهیه شدند. دهانشویههای تحت مطالعه به قرار ذیل بودند: شماره 1: اسانس زیرهی سبز (1 میکرولیتر، 34/3 درصد) + عصارهی آبی چای سبز (21 میکرولیتر، 70 درصد) + عصارهی آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد)، شماره 2: اسانس زیرهی سبز (5/1 میکرولیتر، 5 درصد) + عصارهی آبی چای سبز (5/20 میکرولیتر، 34/68 درصد) + عصارهی آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد)، شماره 3: اسانس زیرهی سبز (3 میکرولیتر، 10 درصد) + عصارهی آبی چای سبز (19 میکرولیتر، 34/63 درصد) + عصارهی آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد)، شماره 4: اسانس زیرهی سبز (6 میکرولیتر، 20 درصد) + عصارهی آبی چای سبز (16 میکرولیتر، 34/53 درصد) + عصارهی آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد)، شماره 5: اسانس زیرهی سبز (12 میکرولیتر، 40 درصد) + عصارهی آبی چای سبز (10 میکرولیتر، 34/33 درصد) + عصارهی آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد). جهت تهیه دهانشویههای مرکب، درصدهای مختلف اسانس و عصارهها با یکدیگر مخلوط شدند و سپس با دستگاه ورتکس همگن گردیدند و تا زمان انجام آزمایش در یخچال نگهداری گردیدند.
آزمایش چاهکگذاری (Punched-Whole Test): در این مطالعه حساسیت ضدقارچی اسانس زیرهی سبز، عصارههای آبی چای سبز و بادرنجبویه و 5 نوع دهانشویه مرکب بر علیه سویهی استاندارد کاندیداآلبیکنس با روش چاهکگذاری سنجش شدند.(15) در ابتدا روی پلیتهای حاوی سابورو دکستروز آگار (شرکت مرک، دارماستاد، آلمان) به ضخامت حدود 4 میلیمتر، یک چاهک به قطر حدود 6 میلیمتر ایجاد شد. سوسپانسیونی از کشت تازهی کاندیدا در آب مقطر با کدورت معادل نیم مک فارلند (cfu/ml 106×5-106×1) تهیه گردید. با استفاده از سوآپ پنبهای استریل آغشته به سوسپانسیون قارچی، سطح پلیتها به طور یکنواخت تلقیح شدند. از هر اسانس مورد آزمایش، مقدار 30 میکرولیتر در داخل چاهکها ریخته شد. پلیتها به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای بین
35-30 سانتیگراد در داخل گرم خانه قرار داده شدند. پس از گذشت زمان مورد نظر، تشکیل قطر هالهی مهار رشد در پیرامون چاهکها مورد بررسی قرار گرفت. قطر هالهی مهار رشد قارچ با خطکش اندازهگیری گردید و نتایج حاصل نیز در جداول مربوطه وارد شدند. ضمناً از محلول دارویی ضدقارچ نیستاتین به عنوان کنترل مثبت آزمایش استفاده شد. آزمایشها برای هر نمونه سه بار تکرار گردید.
روش تجزیه و تحلیل دادهها: برای به دست آوردن نتایج یکسان، آزمایشها برای هر نمونه سه بار تکرار شدند و نتایج بر اساس انحراف معیار±میانگین محاسبه شدند. برای تعیین تفاوت بین گروهها از نظر مهار رشد کاندیداآلبیکنس از آنالیز واریانس یکطرفه (One-way ANOVA) و آزمون تعقیبی توکی با کمک نرمافزار SPSS با ویرایش 16 استفاده شد. سطح معنیداری 05/0 در نظر گرفته شد.
یافتهها
همانگونه که در جدول 1 نشان داده شده است اسانس زیرهی سبز در آزمایش چاهکگذاری بعد از 48 ساعت، اثرات ضدقارچی قوی بر روی سویهی استاندارد کاندیداآلبیکنس نشان داد که میانگین قطر هالهی مهاری ایجاد شده 33/40 میلیمتر بود. عصارهی آبی چای سبز در آزمایش چاهکگذاری بر روی سویهی استاندارد کاندیداآلبیکنس بعد از 48 ساعت، قطر هالهای برابر با 33/6 میلیمتر ایجاد کرده است. چنین به نظر میرسد که عصارهی آبی چای سبز دارای اثرات ضدکاندیدایی نسبتاً ضعیفی میباشد. همچنین بر اساس نتایج حاصل از این آزمایش بر روی عصاره آبی بادرنجبویه، مشخص گردید که این عصاره فاقد اثر ضدکاندیدایی است. آزمون آنالیز واریانس یکطرفه نشان داد که تفاوت معنیدار آماری بین نتایج اسانس زیرهی سبز و عصارههای چای سبز و بادرنجبویه وجود دارد (001/0P<، 588/1=F).
با توجه به تجربیات به دست آمده از طرحهای تحقیقاتی گذشته و مقالات مرتبط با موضوع این تحقیق، 5 نوع دهانشویه با درصدهای مختلف تهیه شدند. نتایج آزمایش حساسیت ضدقارچی 5 دهانشویه مختلف در جدول 2 و تصویر 1 آورده شده است. طبق جدول 2، نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان داد میانگین میزان مهار رشد در دهانشویههای مورد مطالعه تفاوت معنیداری با یکدیگر داشتند (001/0P<، 911/184=F). همچنین در مقایسه دو به دوی گروهها، نتیجه آزمون تعقیبی توکی نشان داد میانگین مهار رشد قارچ در دهانشویه مرکب شماره 1 با دهانشویههای شمارههای 3، 4، 5، 6 و دهانشویه مرکب شماره 2 با دهانشویههای شمارههای 3، 4، 5، 6 و دهانشویه مرکب شماره 3 با دهانشویههای شمارههای 1، 2، 5، 6 و دهانشویه مرکب شماره 4 با دهانشویههای شمارههای 1، 2، 5، 6 و دهانشویه مرکب شماره 5 با دهانشویههای شمارههای 1، 2، 3، 4 و همچنین داروی نیستاتین با دهانشویههای شمارههای 1، 2، 3، 4 تفاوت معنیداری داشتند (001/0P<). اختلاف معنیدار آماری بین داروی نیستاتین و دهانشویه مرکب شماره 5 مشاهده نگردید (تصویر 2).
جدول 1 : نتایج حاصل از آزمایش چاهکگذاری بر روی عصارههای آبی و اسانس گیاهان مورد مطالعه.
نام گیاه |
میانگین (میلیمتر) |
انحراف معیار (میلیمتر) |
عصارهی آبی چای سبز |
33/6 |
57/0 |
عصارهی آبی بادرنجبویه |
عدم ایجاد هاله مهار رشد |
- |
اسانس زیرهی سبز |
33/40 |
52/1 |
نتیجه آنالیز واریانس یکطرفه |
001/0 P< 588/1 = F |
جدول 2 : نتایج حاصل از آزمایش چاهکگذاری بر روی دهانشویههای مرکب شمارههای 1 تا 5.
نوع دهانشویه |
میانگین (میلیمتر) |
انحراف معیار (میلیمتر) |
دهانشویه مرکب شماره 1 |
عدم ایجاد هاله مهار رشد |
- |
دهانشویه مرکب شماره 2 |
عدم ایجاد هاله مهار رشد |
- |
دهانشویه مرکب شماره 3 |
33/10 |
52/1 |
دهانشویه مرکب شماره 4 |
00/14 |
64/2 |
دهانشویه مرکب شماره 5 |
33/22 |
51/2 |
نیستاتین |
66/26 |
52/1 |
نتیجه آنالیز واریانس یک طرفه |
001/0P< 911/184 = F |
تصویر 1 : تشکیل هالهی عدم مهار رشد در آزمایش چاهکگذاری دهانشویه شماره 5.
تصویر 2 : مقایسهی دهانشویه مرکب شماره 5 (B)و داروی نیستاتین (A).
بحث
شیوع بالای مخمر کاندیداآلبیکنس در دهان (75 درصد) و ایجاد اشکال مختلف بالینی مانند برفک، استوماتیت و پرلش،(16) بیانگر اهمیت عفونتهای قارچی دهان و روشهای مناسب درمان آن میباشد. اگرچه مصرف آنتیبیوتیکهای قارچی موجب بهبودی و برطرف شدن عوامل عفونی و عفونت میگردد، ولی استفادهی طولانی مدت آنها هم باعث ظهور قارچهای مقاوم به درمان میشود و هم ضعف و ناتوانی بیمار را به همراه دارد. در سالهای اخیر تحقیق در مورد داروهای گیاهی به سرعت افزایش یافت و به منظور استفاده از مواد شیمیایی گیاهی و پیشرفت در جهت درمان بیماریهای عفونی، رابطه تنگاتنگی بین گیاه شناسان، پزشکان، شیمیدانان و میکروب شناسان ایجاد شده است.
در تحقیقات ما مشخص گردید دهانشویه مرکب حاوی عصارههای آبی چای سبز و بادرنجبویه و اسانس زیرهی سبز میتواند علیه قارچ کاندیداآلبیکنس مؤثر باشد. در این مطالعه، اسانس زیرهی سبز دارای اثر ضدقارچی قوی بر روی سویهی استاندارد کاندیداآلبیکنس (میانگین قطر هالهی مهار رشد برابر با 33/40 میلیمتر)، عصارهی آبی چای سبز دارای اثر ضدکاندیدایی نسبتاً ضعیف (میانگین قطر هالهی مهار رشد برابر با 33/6 میلیمتر) و عصارهی بادرنجبویه فاقد اثر ضدکاندیدایی بودند. بر اساس آزمایشهای به عمل آمده بر روی دهانشویههای مرکب 1 تا 5 مشخص گردید دهانشویه مرکب شماره 5 (شامل عصارههای آبی چای سبز 34/33 درصد، بادرنجبویه 66/26 درصد و اسانس زیرهی سبز 40 درصد) دارای عملکرد بهتری علیه مخمر کاندیداآلبیکنس داشت و با دهانشویههای مرکب شمارههای 1،2 و3 تفاوت معنیداری نشان داد.
نائینی و همکاران(13) اثرات ضدقارچی 50 گیاه درمانی را مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه اثرات ضدقارچی عصارهها و اسانسهای گیاهان مورد نظر با روش آزمایش دیسکگذاری مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد گیاهانی از جمله زیرهی سبز دارای اثر ضدقارچی قوی میباشد. قطر هالهی مهاری در آن آزمایش حدود 45 میلیمتر گزارش شد. در دیگر مطالعهی انجام شده توسط نائینی و همکاران(17)، اثر ضدقارچی 2 گیاه مسواک و زیرهی سبز بر روی سویهی استاندارد جنس کاندیدا (14053ATCC=) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از آزمایش نشان داد اسانس زیرهی سبز اثر ضدقارچی قوی دارد. در این آزمایش قطر هالهی عدم رشد 37 میلیمتر اعلام شده است. نتایج این 2 تحقیق ما را بر آن داشت تا در این تحقیق از اسانس زیرهی سبز به عنوان یکی از ترکیبات دهانشویه مرکب استفاده نماییم. همچنین در مطالعه سالاری و همکاران(18) نشان داده شد که اسانس زیرهی سبز بر روی سویههای کاندیداآلبیکنس جدا شده از مری بیماران مبتلا به ایدز مؤثر است. لذا چنین به نظر میرسد که دهانشویه مرکب پیشنهادی در این تحقیق میتواند کمک مؤثری در بهبود علایم بیماری ایدز داشته باشد. با این حال تحقیقات بیشتر در این زمینه لازم به نظر میرسد. در تحقیقات Mithun و همکاران(19)بر روی عصارهی اتری زیرهی سبز، اثر ضدقارچی ضعیفی مشاهده شد به طوری که قطر هالهی مهار رشد 4 میلی متر بود. در تحقیقات ما نیز عصارهی آبی زیرهی سبز فاقد اثر ضدکاندیدایی بود. چنین به نظر میرسد که عصارهی اتری و آبی زیرهی سبز بر خلاف اسانس آن، فاقد ترکیبات ضدکاندیدایی میباشند. در تحقیقات Hirasawa و همکاران(20) بر روی چای سبز مشخص گردید اپیگالوکاتچین گالات (EGCG)Epigallocatechin-3-gallate استخراج شده ازچای سبز که یک آنتیاکسیدان قوی است هم به صورت جداگانه و هم در ترکیب با داروهای ضدقارچی، علیه کاندیداآلبیکنس مؤثراست.در تحقیق نصرالهی و همکاران(21) اثر بازدارندگی پلیفنولهای برگ سبز چای بر مخمر کاندیداآلبیکنس نشان داده شد و ثابت شد که فعالیت ضدقارچی کاتشین (مؤثرترین ترکیب برگ سبز چای) وابسته به زمان است. علی رغم مشابهت تحقیق نصرالهی و Hirasawaبا پژوهش حاضر، در تحقیق ما بر روی عصارهی آبی چای سبز، اثر ضدکاندیدایی قوی مشاهده نشد. به نظر میرسد نحوهی استخراج وتخلیص مادهی مؤثرهی چای میتواند در میزان تاثیر آن بر روی قارچ کاندیداآلبیکنس نقش مهمی داشته باشد. Antunes و همکاران(22) اثر عصارهی چای سبز را در یک دهانشویهی بدون الکل بر روی پروتزهای آکریلیک بررسی نمودند و گزارش کردند عصارهی آبی چای سبز موجب کاهش تعداد سلولهای کاندیداآلبیکنس در بیوفیلم تشکیل شده بر روی پروتز آکریلیک میگردد.این موضوع میتواند در افرادی که از پروتزهای دندانی استفاده مینمایند مورد بررسی بیشتری قرار گیرد.با توجه به تحقیقات Liu و Chi(6) و تحقیقات مشابه، چای سبز میتواند به طور معنیدار شاخص پلاکهای دندانی را بسیار پایین بیاورد. بنابراین تصمیم گرفته شد تا در دهانشویه مرکب از چای سبز (علیرغم اثر ضدکاندیدایی کم آن) به علت فراوانی و در دسترس بودن و میزان مصرف زیاد آن در جامعه و مهمتر از همه به دلیل داشتن خاصیت ضدپوسیدگی دندان، در ترکیب دهانشویه استفاده شود. در کتب طب سنتی نظیر تحفه حکیم مؤمن، مخزن الادویه و قانون از گیاه بادرنجبویه به عنوان خوشبو کنندهی دهان و جلوگیری از فساد و بوی بد دهان نام برده شده است.(10) شیخ الرئیس ابوعلی سینا در کتاب قانون میگویند: بادرنجبویه در خوشبو نمودن دهان بسیار مؤثر است.(23) سید اسماعیل جرجانی در کتاب الاغراض الطبیه آوردهاند: بادرنجبویه گرم و خشک است و بوی دهان را خوش میکند.(24) انصاری شیرازی در کتاب معروف خود اختیارات بدیعی گفتهاند: بادرنجبویه طبیعت گرم و خشک دارد، بوی دهان را خوش میکند و درد دندان را تخفیف میدهد.(25) با توجه به موارد ذکر شده توسط دانشمندان طب سنتی و نیز اثر ضدویروسی آن در تحقیقات جدید،(26) به نظر میرسد گیاه بادرنجبویه میتواند به عنوان یکی از ترکیبات اصلی در دهانشویه مرکب مورد استفاده قرار گیرد. البته تحقیقات بیشتر درخصوص اثرات مختلف این گیاه بر روی مخاط دهان و دندان ضروری به نظر میرسد. از آن جایی که داروهای ضدقارچی موجود در بازار، هم دارای عوارض جانبی هستند و هم مقاومتهای دارویی ایجاد میکنند، ساخت داروهای گیاهی متشکل از مواد مؤثرهی آنها میتواند جایگزین مناسبی برای درمان بیماریهای قارچی باشد.
نتیجهگیری
بر اساس آنچه در تحقیق ما به دست آمد در مقایسهی بین داروی نیستاتین با ترکیب دهانشویهی شماره 5 حاوی اسانس زیرهی سبز (40 درصد)، عصارهی آبی چای سبز (34/33 درصد) و عصارهی آبی بادرنجبویه (66/26 درصد) اختلاف معنیداری دیده نشد. این امر نشان میدهد که در آینده پس از تایید ارزیابیهای بالینی، میتوان از این ترکیب به عنوان یک دهانشویه برای درمان بیماران مبتلا به کاندیدیازیس دهانی استفاده کرد.
تشکر و قدردانی
این مقاله منتج از پایان نامه به شماره 652 از دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی شاهد میباشد. بدینوسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه جهت پرداخت هزینه پایان نامه تقدیر و تشکر میگردد. همچنین از زحمات پرسنل دانشکده دندانپزشکی و دانشکده پزشکی دانشگاه شاهد نیز قدردانی میشود.
Schnitzler P, Schuhmacher A, Astani A, Reichling J. Melissa officinalis oil affects infectivity of enveloped herpesviruses. Phytomed 2008; 15(9): 734-40.