Comparative Investigation of Cyclin D1 Expression in Oral Lichen Planus and Squamous Cell Carcinoma by Immunohistochemistery Technique

Document Type : original article

Authors

1 Assistant Professor, Dental Research Center, Dep of Oral & Maxillofacial Pathology, School of Dentistry, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran

2 Associate Professor of Oral & Maxillofacial Pathology, AL Zahra Medical Center, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran

3 Associate Professor , Research Center for Modeling of Noncommunicable Disease, Dept of Biostatistics & Epidemiology, School of Public Health, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran

4 Assistant Professor, Dept of Oral & Maxillofacial Pathology, School of Dentistry, Qazvin University of Medical Sciences, Qazvin, Iran

Abstract

Introduction: Oral lichen planus (OLP) is suggested as a lesion capable of transforming to oral squamous cell carcinoma (OSCC). However malignancy potential of the lesion and its relationship to OSCC is a matter of controversy. Since uncontrolled cell proliferation is an indicator of malignant transformation, the aim of this study was to compare cyclin D1 expression in OLP and OSCC lesions.
Materials & Methods: In this descriptive-analytical study, cyclin D1 expression among 3 groups of epithelial hyperplasia ,OLP and OSCC each having 21 samples was investigated using immunohistochemistry staining through quantitative and semi-quantitative methods. One-way ANOVA, Kruskal Wallis, Mann-Withney and Chi-square were used for statistical analysis.
Results: Quantitatively, cyclin D1 expression for epithelial hyperplasia, OLP and OSCC were 13.69±6.00%, 28.38±3.53% and 66.94%±14.49%, respectively. Semi- quantitatively, number of stained cells for epithelial hyperplasia and OLP were less than 35% while for OSCC it was more than 35%. Through quantitative and Semi- quantitative comparison, cyclin D1 expression among the three studied groups overally and either bilaterally was significantly different (P<0.05).
Conclusion: The results showed that cell proliferation of OLP significantly was less than that of OSCC suggesting that is no relationship between the two although pre-malignancyability of OLP is not exactly ruled out. It seems that increasing cell proliferation might be related to malignancy transformation of OLP; therefore, continuous follow-up of the lesion is necessary.

Keywords

Full Text

مقدمه

کارسینوم سلول سنگفرشی دهان (OSCC) یکی از شایع‏ترین سرطان­ها در سرتاسر جهان می‏­باشد.(2و1) OSCC همچنین یک مشکل و معضل بهداشتی جوامع جهانی به شمار می‏­رود که بروز موارد جدید آن سالیانه روبه افزایش است.(3) این تومور بدخیم مهاجم، ناتوانی و مرگ و میر قابل توجه بیماران مبتلا را در پی دارد.(1) با وجود پیشرفت­های فراوان، متوسط بقای 5 ساله آن بسیار کم بوده و در طی چند دهه اخیر بهبودی نیافته است.(3) از این رو تشخیص سریع و زودهنگام آن جهت اعمال روش­های درمانی مناسب در مراحل اولیه بروز ضایعه و بهبود پیش آگهی بیمار ضروری است.(3و2)

بسیاری از OSCCها به دنبال یک ضایعه پیش سرطانی شروع می­شوند.(4و1) این ضایعات بالقوه بدخیم دهانی هر چند لزوماً به کارسینوم تبدیل نمی­گردند(4)، اما به طور قابل ملاحظه­ای با افزایش خطر بروز OSCC همراه هستند.(2) لیکن پلان هانی (OLP) به عنوان یکی ازاین ضایعات مطرح شده است.(2)

OLP یک بیماری مزمن التهابی پوستی – مخاطی و از شایع­ترین اختلالات درماتولوژیکی می­باشد که حفره دهان را درگیر می­سازد، به طوری که حتی ممکن است این جایگاه تنها مکان ابتلا به ضایعه باشد.(6و5) OLP در 3-2% جمعیت و اکثراً در بزرگسالان بالای 40 سال، رخ می­دهد(7و5) و زنان با نسبت تقریبی 4/1 به 1 بیش از مردان مبتلا می­شوند.(6و5) برخلاف مشی بالینی لیکن پلان پوستی که اساساً خطر تغییر بدخیمی ندارد(7) برخی مطالعات نشان داده­اند که بیماران مبتلا به OLP در خطر ابتلا به OSCC هستند.(10-8و6)

سرطان­زایی (کارسینوژنزیس) یک فرایند چندمرحله­ای است که با وقوع جهش­های پی در پی و ناهنجاری­های اپی‏ژنتیک در ژن­های متعدد حادث می­گردد که در این میان ژن­های کنترل‏کننده چرخه سلولی از اهمیت خاصی برخوردار هستند. پیشرفت منظم سلول­ها طی چرخه سلولی به دقت به وسیله یک سری پروتئین به نام سیکلین‏ها هدایت می­شود که نقش خود را با اتصال و فعال نمودن کینازهای وابسته به سیکلین (CDK) به انجام

می­رسانند.(11)

سیکلین D1 پروتئینی 45 کیلودالتونی است و به وسیله ژن CCND1، واقع بر کروموزوم 13q11 کد می‏گردد.(12و11) در طول مراحل مختلف چرخه سلولی (G1→S→G2→M) سیکلین D1 بخشی از سیستم مولکولی است که در تنظیم عبور چرخه سلولی از مرحله G1 به S (نقطه بازرسی G1/S) نقش دارد.(13و11) به طوری که این پروتئین بعد از تولید مجموعه­هایی را با CDK4 و CDK6 تشکیل داده، سبب فسفوریلاسیون پروتئین رتینوبلاستوما (RB) می­شود. با فسفریله شدن RB مهار فعالیت عامل رونویسی E2F برداشته شده و سلول وارد مرحله S می­شود.(14و13و11)

برخلاف عملکرد طبیعی سیکلین D1 به عنوان یک پروتئین کلیدی و تنظیم­کننده­ای مثبت بر پیشرفت منظم چرخه سلولی(14و13و11)، بروز بیش از حد آن سبب کوتاه شدن مرحله G1 و وابستگی کمتر سلول به عوامل رشد می­گردد.(11) چنین شرایطی منجر به از دست رفتن کنترل طبیعی چرخه سلولی و به تبع آن تکثیر (پرولیفراسیون) سلولی کنترل نشده می‏شود.(12و11و1)

با توجه به آن که تکثیر کنترل نشده سلول یکی از مهمترین مکانیسم­های بیولوژیک کارسینوژنزیس به شمار می­رود(15) و تغییر در بروز پروتئین­های مرتبط با آن از شاخصه­های مهم تعیین پتانسیل واقعی تغییر بدخیمی ضایعات به شمار می‏رود،(16و12) در پژوهش حاضر با استفاده از روش رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC) بروز سیکلین D1 در ضایعات OLP و OSCC مورد مقایسه و ارزیابی قرار گرفت تا شاید با استفاده از نتایج این مطالعه بتوان احتمال وقوع تغییرات بدخیمی آتی را در OLP پیش­ بینی نمود.

 

مواد و روش­ها

این پژوهش از نوع گذشته­نگر و توصیفی- تحلیلی بود که به روش مقطعی انجام گردید. پس از بررسی آرشیو بخش پاتولوژی دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی همدان و بیمارستان الزهرای اصفهان طی یک دوره 10 ساله (1390-1380) نمونه­های مطالعه براساس مندرجات پرونده و گزارش آسیب­شناسی بیماران انتخاب شدند. سپس کلیه نمونه­ها توسط 2 پاتولوژیست مورد بازبینی قرار گرفت. قابل ذکر است جهت تائید تشخیص ضایعات OLP از معیارهای تعریف شده توسط Eisenberg استفاده شد.(17) نمونه­های واجد تغییرات دیسپلازی، مشکوک از نظر تشخیص، با ثبوت نامناسب، دارای خونریزی و نکروز کنار گذاشته شدند. همچنین ثبت ریسک فاکتورهای مداخله­گر چون مصرف سیگار، الکل و دارو در پرونده یا تشخیص همزمان ضایعات دیگر (همراه با نمونه­های اصلی) جزء معیارهای خروج از مطالعه بود.

 63 نمونه متشکل از ضایعات هیپرپلازی اپی­تلیالی (گروه کنترل)، لیکن پلان و کارسینوم سلول سنگفرشی دهانی انتخاب شدند (21 نمونه در هر گروه). قابل ذکر است نمونه‏های هیپرپلازی انتخاب شده فاقد دیسپلازی بودند و گروه کارسینوم سلول سنگفرشی متشکل از 13 نمونه (90/61%) دارای تمایز خوب تا متوسط
(Grade I&II) و 8 مورد (10/38%) با درجه تمایز ضعیف (Grade III) بود. رنگ­آمیزی ایمونوهیستوشیمی نمونه‏ها با آنتی­بادی مونوکلونال موشی ضدسیکلین D1 آماده استفاده (دانمارک DAKO، ready-to-use،Code N16187) و به روش پراکسیداز-آنتی پراکسیداز به شرح ذیل انجام گردید:

از هر نمونه برش 4 میکرونی تهیه شده و بر روی لام‏های آماده شده قرار گرفت. لام­ها در دمای c°58 در Oven به مدت 24 ساعت قرار داده شدند و سپس از دو ظرف گزیلل هر یک به مدت 5 دقیقه به منظور پارافین‏زدایی و از الکل با درجات مختلف (از الکل مطلق تا 70 درجه) جهت آب­دهی عبور داده شدند. بعد از شستشو با آب مقطر در مرحله بعد به منظور بازیافت آنتی‏ژنی لام­ها در محلول بافرسیترات با PH=9 گذاشته شد. این مجموعه ابتدا به مدت 5 دقیقه با توان 80 وات و سپس 15 دقیقه با توان 450 وات در مایکروویو قرار گرفت. پس از شستشوی لام­ها (به مدت 15 دقیقه) و خشک شدن آن­ها جهت مهار پراکسیداز داخلی تمامی نمونه­ها در هیدروژن پراکساید 3% به مدت 20 دقیقه انکوبه گردیدند. پس از این مرحله و در حد فاصل مراحل بعدی که به ترتیب شامل افزودن آنتی بادی اولیه، آنتی‏بادی ثانویه، کروموژن دی­آمینوبنزیدین (DAB) و هماتوکسیلین جهت رنگ­آمیزی بود به منظور شستشو از محلول بافر فسفات (Phosphate buffered saline: PBS) استفاده شد. در مرحله نهایی نمونه­ها در الکل با درجات مختلف به منظور آب­گیری و سپس گزیلل به منظور شفاف‏سازی قرار داده شدند و نهایتاً مانت شدند. در تمام مراحل از نمونه Mantle cell lymphoma به عنوان کنترل مثبت برای اطمینان از صحت رنگ آمیزی استفاده گردید.

هسته سلول­های رنگ گرفته با آنتی­بادی (هسته­های قهوه­ای شده) به عنوان رنگ­پذیری مثبت در نظر گرفته شد. جهت شمارش سلول­های رنگ شده با سیکلین D1 از میکروسکوپ نوری (Olympus BX41, Tokyo, Japan) استفاده شد. ابتدا لام­ها در درشت­نمایی پایین (40×) مشاهده شده و مناطق با حداکثر رنگ­پذیری تعیین شدند. سپس با درشت­نمایی 400× در این نواحی تعداد 1000 سلول اپی‏تلیالی شمارش گردید و درصد سلول­های رنگ‏گرفته، لیبل ایندکس (Label Index: LI)، برای هر نمونه محاسبه شد (بررسی کمّی). همچنین بروز نشانگر (مارکر) سیکلین D1 به روش نیمه کمّی نیز بررسی شد. بر این اساس تعداد سلول­های رنگ پذیرفته به انواع کمتر از 1% رنگ گرفته = 0، 1-10% برابر یک مثبت، 10-35% برابر دو مثبت، 35-70% برابر سه مثبت و نمونه­های بیش از 70% رنگ گرفته به عنوان چهار مثبت رتبه­بندی شده و مورد مطالعه قرار گرفتند.(18)

اطلاعات به دست آمده با استفاده از نرم­افزار SPSS با ویرایش 16 و آزمون­های آماری One way ANOVA و Tukey (جهت مقایسه متغیرهای کمی بین گروه­ها)، Krurskal-Wallis و Mann-Whitney (به منظور مقایسه متغیرهای نیمه کمی بین گروه­ها) و 2χ و Fisher Exact (جهت مقایسه متغیرهای کیفی بین گروه‏ها) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. در همه آزمون‏ها سطح معنی­داری کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.

یافته­ ها

یافته­ های مربوط به توزیع فراوانی نمونه­ها (جنس، سن، محل ضایعه) در جدول 1 ارائه شده است.

آزمون 2χ نشان داد که در سه گروه از نظر جنسیت اختلاف معنی دار آماری وجود ندارد (169/0P=). اما از نظر سن بیماران (با استفاده از آزمون One way ANOVA) و محل ابتلای ضایعات (با به کار بردن آزمون Fisher Exact) بین سه گروه مورد مطالعه اختلاف معنی‏دار آماری وجود داشت (001/0>P).

در بررسی رنگ­آمیزی ایمونوهیستوشیمی رنگ­پذیری هسته­ای با نشانگر سیکلین D1 (رنگ­پذیری مثبت) در تمامی گروه­ها (100%) مشاهده گردید (تصاویر 4-1) و شمارش سلولی مطابق آنچه در قسمت مواد وروش­ها شرح داده شد صورت گرفت.

میانگین درصد بروز نشانگر سیکلین D1 در گروه هیپرپلازی اپی­تلیالی 00/6±69/13، در گروه OLP 53/3±38/28 و در گروه OSCC 49/14±94/66 بود. با توجه به اینکه داده‌ها دارای توزیع نرمال نبوده و به سمت راست چوله بودند، از تبدیل لگاریتم استفاده شد که برای گروه هیپرپلازی اپی­تلیالی 22/0±09/1، OLP 06/0±45/1 و OSCC 10/0±82/1 به دست آمد و شرایط آزمون One way ANOVA برقرار شد. این آزمون نشان داد اختلاف معنی­داری به لحاظ بروز سیکلین D1 در گروه­های تحت مطالعه وجود دارد (001/0>P). همچنین با استفاده از آزمون Tukey میانگین درصد رنگ­پذیری سیکلین D1 در بررسی دوبدویی گروه­ها با یکدیگر نیز دارای تفاوت آماری معنی­دار بود (001/0>P).

یافته­های مربوط به مطالعه بروز نشانگر سیکلین D1 به روش نیمه کمی (رتبه­بندی) در گروه­ها در جدول 2 نشان داده شده است.

اختلاف آماری معنی­داری به لحاظ رتبه­بندی نشانگر سیکلین D1 بین سه گروه مورد مطالعه وجود داشت (001/0>P، آزمون Kurskal Wallis). این تفاوت آماری معنی­دار در بررسی دو به دو بین گروه­ها نیز دیده شد (05/0>P، آزمون Mann-Whitney).

قابل ذکر است با توجه به جدول 2 رنگ­پذیری کمتر از 35% در تمام موارد گروه هیپرپلازی اپی تلیالی و OLP (100% نمونه ها) مشاهده شد در حالی که همه نمونه­های گروه OSCC (100% موارد) رنگ­پذیری بیشتر از 35% را نشان دادند.


 

 

جدول 1 : میانگین و انحراف معیار سن، توزیع فراوانی جنس و محل ضایعه به تفکیک گروه‏های مورد مطالعه

لثه

ریج آلوئول مندیبل

کف دهان

بوردر زبان

مخاط

باکال

سن

انحراف معیار±میانگین

زن

تعداد (درصد)

مرد

تعداد (درصد)

تعداد

گروه

8

0

2

1

10

02/12±19/28

13 (9/61)

8 (09/38)

21

هیپرپلازی اپیتلیالی

0

2

4

4

11

37/12±71/32

11 (38/52)

10 (61/47)

21

لیکن پلان دهانی

1

3

2

15

0

33/10±19/62

7 (33/33)

14 (66/66)

21

کارسینوم سلول سنگفرشی

Exact test:

001/0>P

One-way ANOVA

001/0>P

169/0P=

556/3= 2χ

نتیجه آزمون


 

 

 

 

 

تصویر 1 : بروز سیکلین D1 در نمونه هیپرپلازی اپیتلیالی - (بزرگنمایی 100 برابر)

 

تصویر 2 : بروز سیکلین D1 در نمونه لیکن پلان دهانی - (بزرگنمایی 100 برابر)

 

تصویر 3 : بروز سیکلین D1 در نمونه لیکن پلان دهانی - (بزرگنمایی 400 برابر)

 

 

 

 

تصویر 4 : بروز سیکلین D1 در نمونه کارسینومای سلول سنگفرشی دهان - (بزرگنمایی 400 برابر)

 

 


 

جدول 2 : توزیع فراوانی رتبه بندی نشانگر سیکلین D1 در گروه‏های تحت مطالعه برحسب سلول‏های اپی تلیالی مثبت

گروه

تعداد

0

کمتر از 1%

(درصد) تعداد

1+

10%-1%

(درصد) تعداد

2+

35%-10%

(درصد) تعداد

3+

70%-35%

(درصد) تعداد

4+

بیش از 70%

(درصد) تعداد

هیپرپلازی اپیتلیالی

21

(0/0) 0

(5/28) 6

(5/71) 15

(0/0) 0

(0/0) 0

لیکن پلان دهانی

21

(0/0) 0

(0/0) 0

(0/100) 21

(0/0) 0

(0/0) 0

کارسینوم سلول سنگفرشی

21

(0/0) 0

(0/0) 0

(0/0) 0

(4/52) 11

(6/47) 10

کل

63

(0/0) 0

(5/9) 6

(1/57) 36

(4/17) 11

(0/16) 10

001/0> P، Kurskal Wallis test

 

 

 

 


بحث

یکی از ضایعاتی که امروزه به عنوان شرایط پیش‏بدخیم مطرح می­گردد لیکن پلان دهانی است.(8-10و6) بر این اساس اگرچه OLP به لحاظ بالینی نماهای خاص (تیپیک) و کاملا قابل تشخیص دارد(6و5) اما بیوپسی این ضایعه جهت بررسی­های هیستوپاتولوژیک و رد وجود آتیپی سلولی و علائم بدخیمی توصیه شده است.(6) ولی از آنجا که تنها نماهای بالینی یا میکروسکوپی تعیین‏کننده پیشرفت و تبدیل یک ضایعه پیش‏بدخیم به بدخیمی نمی‏باشد، یافتن و شناسایی نشانگرهای مولکولی که می‏توانند معرف چنین ویژگی باشند ضروری به نظر می‏رسد.(19) از دست رفتن کنترل چرخه سلولی و به تبع آن افزایش تکثیر سلولی اساس تغییر بدخیمی به شمار می‏رود(20) و به عنوان یکی از شاخصه­های وجود ناهنجاری‏های ژنتیکی مرتبط با پیشرفت ضایعات پیش‏بدخیم و بدخیم استفاده می­شود.(12) میزان فعالیت تکثیر سلولی را می­توان با مارکرهای معرف آن چون PCNA، Ki67 و سیکلین D1 و به روش ایمونوهیستوشیمی بررسی نمود(12) که در این مطالعه از مارکر سیکلین D1 استفاده شد.

در مطالعه حاضر تمامی نمونه­های گروه کنترل (100%) رنگ­پذیری با سیکلین D1 را نشان دادند که مشابه مطالعه Kotelnikov و همکاران(18) و Hirota و همکاران(21) می­باشد. مغایر با این مطالعات،
Bascones-Martinez و همکاران(22) و Turatti و همکاران(23) بروز این نشانگر را در هیچ یک از نمونه­های گروه کنترل خود گزارش نکردند.

همچنین میزان تکثیر سلولی گروه کنترل بررسی ما نسبت به مطالعه Hirota و همکاران(21) بیشتر بود. این برتری در مقایسه با پرولیفراسیون گروه کنترل برخی مطالعات دیگر (تعیین شده با مارکر Ki67) نیز مشاهده گردید.(26-24)

قابل ذکر است در پژوهش حاضر به دلایل اخلاقی و عدم وجود بلوک مخاط نرمال در آرشیو از نمونه­های هیپرپلازی اپی­تلیالی بعنوان جایگزین گروه کنترل واقعی (مخاط طبیعی دهان) استفاده شد در حالی که در مطالعات مقایسه شده گروه کنترل مخاط نرمال بوده است.(26-24و21)

در هیپرپلازی عوامل رشدی (Growth factors) تولید می‏شوند که با اتصال به گیرنده­های اختصاصی در سطح سلول‏ها مسیرهای پیام­رسانی خاصی را در داخل سلول فعال ساخته و منجر به تحریک تکثیر سلولی می‏گردند. در حالی که در یک بافت نرمال سلول در یک وضعیت ثبات (همئوستازیس) بسر می­برد(27) این امر شاید بتواند علت بیشتر بودن تکثیر سلولی گروه کنترل پژوهش حاضر را نسبت به مطالعات دیگر(26-24و21) توضیح دهد.

در مطالعه ما همچون گزارش Hirota و همکاران(21)

بروز سیکلین D1 در تمامی نمونه­های گروه OLP (100%) دیده شد اما میزان تکثیر سلولی بدست آمده بیشتر از پرولیفراسیون گروه OLP در مطالعه Hirota و همکاران بود.(21) همچنین در مقایسه با دیگر مطالعات (انجام شده با سایر مارکرهای پرولیفراسیون) نتیجه شمارش ما بسیار نزدیک به مطالعه Lee و همکاران(28) (مارکر PCNA) و کمتر از مطالعه Taniguchi و همکاران(29) (مارکر Ki67) بود.

در تحقیق حاضر بروز سیکلین D1 در 100% نمونه­های گروه OSCC وجود داشت. این یافته مغایر با مطالعه Turatti و همکاران(23) و Bascones-Martinez و همکاران(22) بود که به ترتیب بروز این مارکر را در 6/66% و 6/46% نمونه­های OSCC گزارش نمودند.

در مقایسه میزان پرولیفراسیون گروه OSCC مطالعه حاضر با مطالعات موجود نیز مشخص گردید که نسبت به مطالعه Kotelnikov و همکاران(18) (نمونه­های مورد استفاده: SCC­های سر و گردن، مارکرسیکلینD1 ) و Kurokawa و همکاران(25) (مارکر Ki67)، بیشتر ولی مشابه با مطالعه Saito و همکاران(30)) (مارکرKi67) ­بود. ضمن در نظر گرفتن ناهمگونی بافت­های مورد بررسی و گاهی استفاده از نشانگرهای مختلف، تفاوت­ها در مطالعات فوق (به ویژه در مواردی که نشانگر مورد استفاده مشابه بوده است) شاید بیانگر وجود مشکلات در بررسی­های ایمونوهیستوشیمی برش­های بافتی حاصل از بلوک­های پارافینی باشد. به نظر می­رسد عوامل متعددی چون استفاده از مواد و روش­های غیراستاندارد در نگهداری، ثابت کردن بافت­ها و طی مراحل تهیه بلوک پارافینی، کاربرد روش­های مختلف رنگ­آمیزی ایمونوهیستوشیمی، نوع آنتی­بادی به کار برده شده (مونوکلونال/ پلی کلونال) و شرکت سازنده آن می­تواند

بر نتایج حاصل از این شیوه بررسی تاثیرگذار باشد.

در مطالعه حاضر میزان تکثیر سلولی گروه­ها به دو روش کمی و نیمه کمی مورد بررسی قرار گرفت که حاکی از افزایش معنی‏دار پرولیفراسیون از گروه کنترل تا OSCC بود.

در بررسی دوبه دو بین گروه­ها نیز تکثیر سلولی گروه OLP از گروه کنترل به طور معنی­داری بیشتر بود که این یافته با نتایج حاصل از مطالعات موجود (البته با گروه کنترل مخاط نرمال و کاربرد یکی از مارکرهای پرولیفراسیون) مشابهت داشته است.(34-31و29و28و21) در این مطالعه بیشتر بودن پرولیفراسیون گروه OLP در مقایسه با هیپرپلازی اپی‏تلیالی را شاید بتوان با التهاب مزمن، آزاد شدن واسطه­های التهابی و سیتوکاین­های اختصاصی از سلول­های التهابی موجود در این دسته از ضایعات مرتبط دانست.

در OLP برخی از سیتوکاین­های پیش التهابی (کموکاین­ها) توسط سلول­های لنفوسیت T ترشح می­شود که می­توانند ماست­سل­ها را به داخل ضایعه جذب کرده و دگرانولاسیون آن­ها را تحریک نمایند.(5) دگرانولاسیون ماست­سل­ها با آزاد شدن TNF-α  و کیمازها همراه است که خود سبب افزایش تنظیمی (UP-regulation) لنفوسیت‏های T جهت ترشح مجدد کموکاین­ها می‏گردد(5)، بنابراین در حالی که هیپرپلازی اپی­تلیالی یک سازگاری سلولی محسوب می‏شود که به موجب آن وضعیتی تغییر یافته اما با ثبات جدید حاصل شده است(27) در لیکن پلان دهانی چرخه­ای معیوب در حال تکرار شدن است که ضمن مزمن نمودن التهاب به نظر می­رسد می‏تواند تکثیر سلول­های اپی­تلیالی را نیز متاثر سازد.(35،31و5)

ارتبـاط بین سـرطان و الـتهاب در مـطالعات بسیاری

بررسی شده و یافته­ها به رابطه­ای مثبت بین التهاب مزمن و سرطان­ اشاره دارد.(38-36) ارتشاح التهابی به عنوان یک ریسک فاکتور قوی برای ایجاد بدخیمی در وضعیت­های التهابی مزمن چون کولیت اولسراتیو، مری بارت و گاستریت آتروفیک در نظر گرفته شده است و اخیراً نیز پیشنهاد گردیده که OLP را هم می­توان به این گروه اضافه نمود.(34) سلول­های التهابی و انواع واسطه­های التهابی آنها چون سیتوکاین­ها، کموکاین­ها و آنزیم­ها از طریق تسهیل رگزایی، افزایش تولید ماتریکس متالوپروتئینازها، تخریب غشاء پایه و افزایش تکثیر سلولی میکرو محیطی مناسب برای شروع تغییرات بدخیمی و ایجاد سرطان به وجود می­آورند.(39)

افزایش تکثیر سلولی بعنوان یکی از اولین شاخصه­های بدخیمی مطرح شده و یک رویداد کلیدی در ایجاد سرطان به شمار می­رود.(20) از این رو شاید بتواند جزء تغییراتی محسوب شود که حتی با عدم وجود نماهای بالینی و هیستوپاتولوژیک یک نئوپلاسم بدخیم، بیانگر وقوع مرحله ابتدایی کار سینوژنزیس بوده و نشان دهد که یک ضایعه ظاهراً خوش­خیم تحت تغییرات بدخیمی واقع گردیده است.(4) اما در مطالعه حاضر تکثیر سلولی در OSCC به طور معنی‏داری بیشتر از OLP بود که مشابه نتایج حاصل از مطالعات de Sousa و همکاران(20و9) و Lee و همکاران(28) می­باشد (مارکر مورد استفاده مطالعات PCNA). در مقایسه با OSCC کمتر بودن پرولیفراسیون سلولی OLP در پژوهش حاضر شاید حاکی از آن باشد که در این گروه از ضایعات هنوز برخی مکانیسم­های حفاظتی فعال بوده و نقش خود را به طور مناسب و کارآمد ایفاء می­نمایند.

به عنوان مثال، تکثیر سلولی در OLP تلاشی جهت حفظ ضخامت اپی­تلیوم و جلوگیری از زخم شدن آن عنوان شده است.(35و34) اما به نظر می­رسد مکانیسم­هایی حفاظت­کننده مانع از تکثیر بی­رویه سلول می­شوند، یکی از آن­ها حذف سلول­ها از طریق فعال شدن مسیر آپوپتوز (مرگ برنامه­ریزی شده سلول) می­باشد. به عنوان مثال Fan و همکاران(40) نشان دادند که بروز بیش از حد Bax (پروتئین القاء کننده آپوپتوز) با مرگ برنامه­ریزی شده سلول­های اپی­تلیالی در OLP مرتبط است. de Sousa و همکاران(9) هم گزارش نمودند که با تکثیر سلولی بیشتر در ضایعات OLP بروز Bax بیشتری نیز مشاهده شده است.(9) این امر به ویژه اجازه به حذف سلول­هایی می‏دهد که دارای آسیب ژنتیکی غیرقابل برگشت هستند و از این طریق از فعالیت کارسینوژن­ها بر روی اپی­تلیوم کاسته می­شود.(9)

مکانیسم دیگر در مقابله با افزایش تکثیر سلولی ناشی از التهاب در OLP شاید افزایش قابل ملاحظه در گیرنده‏های (رسپتورهای) TNF-αسلول­های اپی­تلیالی این ضایعه باشد که می­تواند در مهار پرولیفراسیون نقش داشته باشد.(31)

از طرفی، عنوان شده رابطهء مستقیمی بین میزان بروز P16 (پروتئین مهارکننده چرخه سلولی) و درجه التهاب بافتی وجود دارد. بروز بیش از حد این پروتئین در تحریکات التهابی مزمن (چون OLP) با میزان بالای
TNF-α مرتبط بوده و در راستای محدود کردن تکثیر سلولی صورت می­گیرد تا از رشد کنترل نشده سلول­های اپی­تلیالی شبه بدخیم (Malignant-Like) جلوگیری نماید.(41)

در مجموع می­توان چنین انگاشت که در پی وقوع تکثیر سلولی در OLP این روند کنترل شده بوده و بین تنظیم­کننده­های مثبت و منفی آن تعادل وجود دارد. اما باید در نظر داشت که این یافته­ها الزاماً ایجاد تغییرات بدخیمی در OLP را رد نمی­کند. بسیار مهم است به این نکته اشاره نماییم که در ضایعات التهابی مزمن محصولاتی توسط سلول­های التهابی تولید می­شوند که می­توانند از طریق آسیب به DNA سلولی، نقص در پاسخ­های محافظت­کننده وابسته به P53 (ژن سرکوبگر تومور) و تجمع جهش­های (موتاسیون­های) انکوژنیک به عنوان عوامل موتاسیون­زا برای سلول­های اپی­تلیالی عمل نمایند.(39) بنابراین هر چه میزان تکثیر سلولی در لیکن پلان دهانی بیشتر باشد احتمال وجود سلول­های موتاسیون یافته افزایش می­یابد که می­تواند ایجاد بدخیمی در این ضایعه را به دنبال داشته باشد.(34)

در این زمینه یافته­های حاصل از بررسی نیمه کمی بروز نشانگر سیکلین D1 درنمونه‏های OLP و OSCC تحقیق حاضر حائز اهمیت است.

در تمامی نمونه­های OLP مورد بررسی میزان بروز سیکلین D1 کمتر از 35% بود در حالی که در گروه OSCC تمامی نمونه­ها رنگ­پذیری بیشتر از 35% را نشان دادند. بر مبنای این نتیجه شاید بتوان حد متمایزکننده (Cut-off) تکثیر سلولی ضایعات OLP و OSCC را از یکدیگر رنگ­پذیری سلول­های اپی­تلیالی به میزان 35% با نشانگر سیکلین D1 در نظر گرفت و پیشنهاد نمود که در نمونه­های OLP با بروز کمتر از 35% به احتمال زیاد مکانیسم­های حفاظت­کننده بدرستی عملکرد خود را انجام می‏دهند، توانایی و ظرفیت حذف سلول­های واجد موتاسیون و تغییرات ژنتیکی را دارند و بنابراین ثبات ژنومی این ضایعات حفظ می­گردد.

در حالی که اگر تکثیر سلولی بیش از 35% باشد (عبور از نقطهء Cut-off) به دلیل همپوشانی و شباهت با میزان پرولیفراسیون سلولی ضایعات OSCC، احتمال وجود سلول­های جهش یافته و نقص در ساز و کارهای محافظت­کننده بیشتر شده و امکان وقوع تغییرات بدخیمی در این دسته از ضایعات OLP افزایش می­یابد.

البته باید به این نکته نیز توجه داشت هرچند افزایش تکثیر سلولی به عنوان یکی از مهمترین علائم شروع کارسینوژنزیس مطرح گشته است،(20و15) اما تایید و استفاده از Cut-off پیشنهاد شده با در نظر گرفتن محدودیت‏های انجام مطالعه حاضر، از قبیل تعداد کم نمونه‏ها و همچنین عدم وجود مطالعه‏ای مشابه نیازمند انجام تحقیقات بیشتر و گسترده‏تر می‏باشد

نتیجه­ گیری

اگرچه پیشنهاد شده است بیماران مبتلا به OLP در خطر ابتلای بیشتری به OSCC هستند، اما درخصوص ارتباط بین OLP و OSCC اختلاف نظر وجود داشته و پتانسیل بدخیمی OLP هنوز اثبات نشده است. یافته­های پژوهش حاضر با نشانگر سیکلین D1 حاکی از آن بود که تکثیر سلولی در ضایعات OLP به طور معنی‏داری کمتر از نمونه­های OSCC می‏­باشد. این مساله هشداری برای کلینیسین­ها خواهد بود که بیماران مبتلا به OLP، به ویژه آن دسته که دارای افزایش تکثیر سلولی هستند، را همواره تحت پیگیری­های دوره­ای منظم و معاینات دقیق و مستمر قرار دهند تا کوچکترین تغییر ایجاد شده در ضایعات آن­ها در همان مراحل اولیه شناسایی شود و درمان مناسب صورت گیرد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی همدان به خاطر حمایت مالی از این پژوهش تقدیر و تشکر می‏نمایند. شایان ذکر است این مقاله منتج از پایان نامه دکتر مهرناز علی خاصی با شماره 81 جهت دریافت درجه دکترای تخصصی دندانپزشکی در رشته آسیب شناسی دهان، فک و صورت به راهنمایی دکتر معصومه زرگران و دکتر شکوفه جمشیدی می‏باشد.

References

  1. Wilkey JF, Buchberger G, Saucier K, Patel SM, Eisenberg E, Nakagawa H, et al. Cyclin D1 overexpression increases susceptibility to 4-nitroquinoline-1-oxide-induced dysplasia and neoplasia in murine squamous oral epithelium. Mol Carcinog 2009; 48(9): 853-61.
  2. Ma LW, Zhou ZT, He QB, Jiang WW. Phospholipase C-γ1 expression correlated with cancer progression of potentially malignant oral lesions. J Oral Pathol Med 2013; 42(1): 47-52.
  3. Ahmed MM. Expression profile of apoptotic mediators and proliferative markers in oral squamous cell carcinoma. J Egypt Natl Canc Inst 2009; 21(2): 85-92.
  4. Acay RR, Felizzola CR, de Araújo N, de Sousa SO. Evaluation of proliferative potential in oral lichen planus and oral lichenoid lesions using immunohistochemical expression of p53 and Ki67. Oral Oncol  2006; 42(5): 475-80.
  5. Roopashree MR, Gondhalekar RV, Shashikanth MC, George J, Thippeswamy SH, Shukla A. Pathogenesis of oral lichen planus-a review. J Oral Pathol Med 2010; 39(10): 729-34.
  6. Gorsky M, Epstein JB. Oral lichen planus: Malignant transformation and human papilloma virus: A review of potential clinical implications. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2011; 111(4): 461-4.
  7. Jaafari-Ashkavandi Z, Mardani M, Pardis S, Amanpour S. Oral mucocutaneous diseases: Clinicopathologic analysis and malignant transformation.  J Craniofac Surg 2011; 22(3): 949-51.
  8. de Sousa FA, Paradella TC, Carvalho YR, Rosa LE. Comparative analysis of the expression of proliferating cell nuclear antigen, p53, bax, and bcl-2 in oral lichen planus and oral squamous cell carcinoma. Ann Diagn Pathol 2009; 13(5): 308-12.
  9. Rajentheran R, McLean NR, Kelly CG, Reed MF, Nolan A. Malignant transformation of oral lichen planus.  Eur J Surg Oncol 1999; 25(5): 520-3.
  10. Liu SC, Klein-Szanto AJ. Markers of proliferation in normal and leukoplakic oral epithelia. Oral Oncol 2000; 36(2): 145-51.
  11. Das SN, Khare P, Singh MK, Sharma SC. Correlation of cyclin D1 expression with aggressive DNA pattern in patients with tobacco-related intraoral squamous cell carcinoma. Indian J Med Res 2011; 133: 381-6.
  12. Huang SF, Cheng SD, Chuang WY, Chen IH, Liao CT, Wang HM, et al. Cyclin D1 overexpression and poor clinical outcomes in Taiwanese oral cavity squamous cell carcinoma. World J Surg Oncol 2012; 10: 40.
  13. Motta Rda R, Zettler CG, Cambruzzi E, Jotz GP, Berni RB. Ki-67 and p53 correlation prognostic value in squamous cell carcinomas of the oral cavity and tongue. Braz J Otorhinolaryngol 2009; 75(4): 544-9.
  14. Sousa FA, Paradella TC, Carvalho YR, Rosa LE. Immunohistochemical expression of PCNA, p53, bax and bcl-2 in oral lichen planus and epithelial dysplasia. J Oral Sci 2009; 51(1): 117-21.
  15. Eisenberg E. Oral lichen planus: A benign lesion. J Oral Maxillofac Surg 2000; 58(11): 1278-85.
  16. Kotelnikov VM, Coon JS 4th, Mundle S, Kelanic S, LaFollette S, Taylor S IV, et al. Cyclin D1 expression in squamous cell carcinomas of the head and neck and in oral mucosa in relation to proliferation and apoptosis. Clin Cancer Res 1997; 3(1): 95-101.
  17. Pitiyage G, Tilakaratne WM, Tavassoli M, Warnakulasuriya S. Molecular markers in oral epithelial dysplasia: Review. J Oral Pathol Med 2009; 38(10): 737-52.
  18. de Sousa FA , Paradella TC, Carvalho YR, Rosa LE B. Comparative analysis of cell proliferation ratio in oral lichen planus, epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinoma. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2009; 14(11): 563-7.
  19. Hirota M, Ito T, Okudela K, Kawabe R, Yazawa T, Hayashi H, et al. Cell proliferation activity and the expression of cell cycle regulatory proteins in oral lichen planus. J Oral Pathol Med 2002; 31(4): 204-12.
  20. Bascones-Martínez A, López-Durán M, Cano-Sánchez J, Sánchez-Verde L, Díez-Rodríguez A, Aguirre-Echebarría P, et al. Differences in the expression of five senescence markers in oral cancer, oral leukoplakia and control samples in humans.  Oncol Lett 2012; 3(6): 1319-25.
  21. Turatti E, da Costa Neves A, de Magalhães MH, de Sousa SO. Assessment of c-Jun, c-Fos and cyclin D1 in premalignant and malignant oral lesions. J Oral Sci 2005; 47(2): 71-6.
  22. Kurokawa H, Matsumoto S, Murata T, Yamashita Y, Tomoyose T, Zhang M, et al. Immunohistochemical study of syndecan-1 down-regulation and the expression of p53 protein or Ki-67 antigen in oral leukoplakia with or without epithelial dysplasia.  J Oral Pathol Med 2003; 32(9): 513-21.
  23. Kurokawa H, Zhang M, Matsumoto S, Yamashita Y, Tanaka T, Tomoyose T, et al. The relationship of the histologic grade at the deep invasive front and the expression of Ki-67 antigen and p53 protein in oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med 2005; 34(10): 602-7.
  24. Montebugnoli L, Badiali G, Marchetti C, Cervellati F, Farnedi A, Foschini MP. Prognostic value of Ki67 from clinically and histologically 'normal' distant mucosa in patients surgically treated for oral squamous cell carcinoma: A prospective study. Int J Oral Maxillofac Surg 2009; 38(11): 1165-72.
  25. Kumar V, Abbas A, Fausto N. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. 8th ed. W. B. Saunders Co. 2010. P. 5-9.
  26. Lee JJ, Kuo MY, Cheng SJ, Chiang CP, Jeng JH, Chang HH, et al. Higher expressions of p53 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in atrophic oral lichen planus and patients with areca quid chewing. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2005; 99(4): 471-8.
  27. Taniguchi Y, Nagao T, Maeda H, Kameyama Y, Warnakulasuriya KA. Epithelial cell proliferation in oral lichen planus. Cell Prolif 2002; 35(1): 103-9.
  28. Saito T, Nakajima T, Mogi K. Immunohistochemical analysis of cell cycle - associated proteins P16, pRb, P53, P27 and ki67 in oral cancer and precancer with special referece to verrucous carcinomas. J Oral Pathol Med 1999; 28(5): 226-32.
  29. da Silva Fonseca LM, do Carmo MA. Identification of the Ag-NORs, PCNA and ck16 proteins in oral lichen planus lesions. Oral Dis 2001; 7(6): 344-8.
  30. Flatharta CO, Flint S, Toner M, Mabruk M. hTR RNA component as a marker of cellular proliferation in oral lichen planus. Asian Pac J Cancer Prev 2008; 9(2): 287-90.
  31. Tipoe GL, Jin Y, White FH. The relationship between vascularity and cell proliferation in human normal and pathological lesions of the oral cheek epithelium. Eur J Cancer B Oral Oncol 1996; 32(1): 24-31.
  32. González Moles MA, Esteban F, Ruiz-Avila I, Gil Montoya JA, Brener S, Bascones-Martínez A, et al. A role for the substance P/NK-1 receptor complex in cell proliferation and apoptosis in oral lichen planus. Oral Dis 2009; 15(2): 162-9.
  33. Karatsaidis A, Schreurs O, Helgeland K, Axéll T, Schenck K. Erythematous and reticular forms of oral lichen planus and oral lichenoid reactions differ in pathological features related to disease activity. J Oral Pathol Med 2003; 32(5): 275-81.
  34. Balkwill F, Mantovani A. Inflammation and cancer: Back to Virchow?. Lancet 2001; 357(9255): 539-45.
  35. Philip M, Rowley DA, Schreiber H. Inflammation as a tumor promoter in cancer induction. Semin Cancer Biol 2004; 14(6): 433-9.
  36. Coussens LM, Werb Z. Inflammation and cancer. Nature 2002; 420(6917): 860-7.
  37. Lu H, Ouyang W, Huang C. Inflammation, a key event in cancer development. Mol Cancer Res 2006; 4(4): 221-33.
  38. Fan Y, Zhan Z, Peng T, Song XL, Feng ZQ. The expression of apoptosis-associated proteins Bcl-2, Bax in oral leukoplakia and lichen planus. Shanghai Kou Qiang Yi Xue 2004; 13(6): 497-501. (Chinese)

6.       Sousa FA, Rosa LE. Oral lichen planus: Clinical and histopathological considerations. Braz J Otorhinolaryngol  2008; 74(2): 284-92.

11.    Saawarn S, Astekar M, Saawarn N, Dhakar N, Gomateshwar Sagari S. Cyclin D1 expression and its correlation with histopathological differentiation in oral squamous cell carcinoma. Sci World J 2012; 2012: 978327.

Montebugnoli L, Venturi M, Gissi DB, Leonardi E, Farnedi A, Foschini MP. Immunohistochemical expression of p16 (INK4A) protein in oral lichen planus. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod  2011; 112(2): 222-7.

Files

History

  • Receive Date: 12 January 2014
  • Accept Date: 12 January 2014

Share

How to cite

Statistics