Synthesis and Characterization Properties of Gelatin-Fluorhydroxyapatite Composite Scaffold for Application in Bone Tissue Engineering and Investigation of Cellular Attachment

مقدمه

مهندسی بافت، علمی میان رشته­ ای است که با بکارگیری قوانین مهندسی و علوم بیولوژی، رویکردی نوین جهت ترمیم بافت­ های طبیعی بدن، ارائه می­ دهد.^(2و1) در مهندسی بافت، وجود داربست زیست تقلیدی مناسب، برای بقای سلول­ ها ضروری است. داربست­ ها باید ریزمحیط طبیعی اطراف سلول ­ها را محیا کنند و از چسبندگی سلولی، لنگراندازی، تکثیر و مهاجرت سلول­ ها حمایت به عمل آورند. مدول الاستیک فلزات بالاتر از GPa100 می ­باشد که به مراتب بالاتر از میزان سفتی استخوان متراکم خواهد بود. نتیجه این سفتی بالا، بروز پدیده حفاظت تنشی روی استخوان در حال رشد است که منجر به نازکی بافت جدید استخوانی خواهد شد و احتمال شکست مجدد آن را افزایش خواهد داد.⁽³⁾ مشکلاتی از این قبیل، توجه بسیاری از پژوهشگران را به سوی مواد جدیدتری معطوف نمود. بدین ترتیب باب جدید موسوم به مهندسی بافت استخوان بازشد و بیومتریال ­های نوینی برای این منظور به جامعه پزشکی معرفی گردید. به طور کلی مهندسی بافت را می­ توان تحت عنوان کاربرد اصول علمی جهت طراحی، ساخت، اصلاح، رشد و ابقاء بافت­ های زنده بدن تعریف نمود که به موجب آن خواص یک بیومتریال به گونه ­ای دستخوش تغییرات قرار می­ گیرد که قادر به تشکیل بافت یا رهایش توده­ای از سلول­ ها به داخل بدن میزبان باشد و نهایتا منجر به تشکیل بافت جدید گردد.^(6-4) بنابراین می­توان گفت که روش مهندسی بافت استخوان بر اساس بکارگیری بیومتریال هایتخریب پذیر استوار است و علیرغم تنوعی که دارد، غالبا ازیک قاعده کّلی تبعیت می­کند که مراحل آن ساخت یک داربست یا حامل تخریب پذیر، بارگذاریسلول­ ها، داروها، پروتئین­ های رشد و بطور عموم عواملبرانگیزنده رشد استخوان و در نهایت کاشت موثر مجموعه در موضع مورد نظر را شامل می­شود.⁽⁷⁾

داربست متخلخل در درون بدن شروع به تخریب شدن می ­نماید و همزمان با آن، سلول­ های کشت شده در داخل سازه به رشد و تکثیر خود ادامه می ­دهند تا اینکه نهایتا بافت استخوانی جدید جایگزین آن می ­شود. به چنین مجموعه ­هایی مجموعه سلولی اطلاق می­ گردد. البته علاوه بر این مجموعه ­ها، از مجموعه­ های غیر سلولی نیز در مهندسی بافت استخوان استفاده شده است ولی بکارگیریمجموعه های سلولی عملا نتایج مناسب­ تری را به بار می ­آورد.⁽⁸⁾ در مجموعه ­های غیر سلولی خاصیت استخوان سازی توسط خود ماده ایمپلنت القاء می­گردد لذا بیومتریال بکار رفته یا باید از قابلیت تحریک استخوان­ سازی بالایی برخوردار باشد و یا اینکه حاوی مواد برانگیزنده استخوان سازی همچون فاکتورهای رشد و پروتئین­ های زمینه خارج سلولی باشد تا موجب تشکیل استخوان در موضع گردد. ⁽⁹⁾

به طور کلی سه گروه پلیمرها، سرامیک­ ها و کامپوزیت­ ها نامزدهای ماده داربستی هستند. پلیمرهای طبیعی که در این زمینه بکار می روند، عبارتند از کلاژن یا شکل تغییر یافته آن (ژلاتین)، زمینه استخوان مینرال زدایی شده و مشتقات کیتین.^(10و5) در میان پلیمرهای مصنوعی نیز پلی لاکتیک اسید، پلی گلایکولیک اسید و کوپلیمرهای آنها از بیشترین کاربرد در مهندسی بافت استخوان برخوردارند. ^{(15-12و11و7و5)}

مواد سرامیکی دسته دیگری از بیومتریال­ های بکار رفته در مهندسی بافت استخوان می­باشند. در میان سرامیک­ هایی که در این زمینه مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته­ اند، سرامیک­ های کلسیم فسفاتی وسیع­ ترین تحقیقات را به خود اختصاص داده­اند که معروف ترین آن­ها عبارتند از هیدروکسی آپاتیت، تری کلسیم فسفات، تترا کلسیم فسفات و کلسیم فسفات آمورف.^(6و5) با این حال فلوئورهیدروکسی آپاتیت می­ تواند جایگزین مناسبی برای هیدروکسی آپاتیت باشد و نواقص آن­ را جبران کند. فاز معدنی مینای دندان که از آپاتیت تشکیل شده است، 04/0 تا 07/0 درصد وزنی آن فلوراید بوده و تقریبا 95 تا 97 درصد جرم خشک مینای دندان را شامل می­شود. یون فلوئور در بزاق دهان و پلاسمای خون وجود داشته و برای رشد طبیعی دندان و استخوان­ ها ضروری می­ باشد. یون فلوراید قابلیت درمانی در ترمیم پوکی استخوان دارد چرا که با اعمال آن، جرم استخوان افزایش می­ یابد. همچنین این یون موجب تحریک فعالیت سلول­ های استخوانی در محیط برون­تن و درون­تن می ­شود. فلوئورهیدروکسی آپاتیت پایداری حرارتی و شیمیایی بهتری نسبت به هیدروکسی آپاتیت دارد که این پدیده با توجه به ساختار کریستالی هیدروکسی آپاتیت قابل توجیه است. فلوئورهیدروکسی آپاتیت به هنگام استفاده در جایگزین­ های استخوانی، زیست سازگاری و هدایت استخوانی خوبی را از خود به نمایش می­ گذارد.⁽¹⁶⁾ نقطه قوت فسفات­ های کلسیم به خاصیت زیست ­سازگاری آن­ها برمی­ گردد که معلول تشکیل لایه غنی از کلسیم –فسفر در سطح این مواد می ­باشد.⁽¹⁷⁾ وجود چنین لای ه­ای به اتصال شیمیایی میان استخوان و ایمپلنت کمک می­کند.

تحقیقات نشان داده ­اند که با بکارگیری سرامیک­ ها در کنار مواد پلیمری، علاوه بر امکان حصول خواص مکانیکی بهتر، درجه زیست سازگاری و قابلیت استخوان سازی ایمپلنت نیز به میزان چشمگیری افزایش خواهد یافت. علاوه بر این مشکل محصولات جانبی اسیدی پلیمرها نیز برطرف خواهد شد.^(19و18و16) بنابراین روشن است که با بکارگیری کامپوزیت­ هایی از پلیمرهای طبیعی و سرامیک­ های فسفات کلسیمی در ساخت جایگزین­ های تخریب­پذیر.^(22-20) می­توان ماده ­ای نزدیک­تر به خواص استخوان طبیعی فراهم نمود.

مواد و روش­ها

برای سنتز نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت از روش هم­ رسوبی استفاده شد. در این روش از پودرهای کلسیم­ نیترات، دی آمونیوم هیدروژن فسفات و آمونیوم فلوراید، به عنوان مواد اولیه استفاده شد. در ابتدا پودرهای دی آمونیوم هیدروژن فسفات و آمونیوم فلوراید با نسبت مولی 3 به 1 در مقادیر مشخص آب مقطر حل شدند، سپس میزان pH محلول فسفاتی با استفاده از آمونیاک به 11 رسید. در ادامه محلول فسفاتی به صورت قطره قطره به محلول کلسیم نیتراتی (نسبت کلسیم به فسفر 67/1 مول) اضافه گردید. محلول حاصل پس از 4 ساعت قرار­گیری بر روی همزن مغناطیسی، از صافی عبور داده شد و رسوبات حاصل از آن با آب مقطر شست ­و ­شو داده شدند و بعد از خشک شدن، به مدت 45 دقیقه و در دمای 700 درجه سانتی­گراد کلسینه شدند. سپس محلولی از ژلاتین در آب مقطر دیونیزه شده با غلظت 10 درصد تهیه شد. پس از انحلال کامل ژلاتین، پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت به محلول اضافه گردید و محلول نهایی در دمای 60 درجه سانتی­گراد و به مدت 1 ساعت به خوبی هم زده شد تا ذرات فلوئورهیدروکسی آپاتیت به طور کاملا یکنواخت در محلول ژلاتین پراکنده شوند. با تغییر مقادیر فلوئورهیدروکسی آپاتیت افزوده شده، نسبت ­های وزنی مختلف 40، 50 و 60 درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت به ترتیب برای نمونه­ های S₁، S₂ و S₃ طبق جدول 1 بدست آمد. علاوه بر این، فلوچارت تهیه نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت که به روش هم رسوبی به منظور اختلاط با ژلاتین تهیه شد، در تصویر 1 قابل مشاهده می­باشد.

تصویر 1 : نمودار تهیه نانو پودر فلوئورهیدروکسی­آپاتیت به روش هم­رسوبی

جدول 1 : ترکیب شیمیایی نمونه­ها

سپس در دمای منفی 57 درجه سانتی­گراد و به مدت 24 ساعت، نمونه­ ها تحت عملیات خشکایش انجمادی قرار گرفتند. پس از انجماد بچ ریخته شده، لایه بدست آمده به ابعاد مطلوب بریده شد و در درجه حرارت اتاق به مدت 24 ساعت رها شد تا کاملا خشک گردد. سپس هریک از قطعات حاصله به مدت دوساعت در محلول گلوتارآلدئید قرار داده شدند تا در این فاصله اتصالات عرضی لازم در شبکه ژلاتینی رخ دهد و آن را تبدیل به ژلاتین نامحلول نماید تا در اثر تماس با رطوبت دچار تغییر ساختار و خواص نشود. پس از شبکه ­ای شدن ژلاتین، نمونه­ ها جهت شست و شو و حذف بقایای گلوتارآلدئید، به مدت 24 ساعت در آب مقطر شست و شو داده شدند. سپس نمونه­ ها به مدت 8 ساعت در درجه حرارت اتاق رها شدند تا رطوبت اولیه آن­ها گرفته شود و خشک گردند و سپس در دمای 40 درجه سانتی­گراد رطوبت نهایی نمونه­ ها گرفته شد. شکل 2 تصویری از داربست ژلاتین/ فلوئورهیدروکسی آپاتیت می­باشد که به روش خشکایش انجمادی تهیه شده است. 

تصویر 2 : تصویر داربست ژلاتین- فلوئورهیدروکسی آپاتیت سنتز شده به روش خشکایش انجمادی

به منظور تعیین ساختار کریستالی و ترکیب شیمیایی فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ژلاتین و داربست­های کامپوزیتی از روش پراش پرتو ایکس (XRD, BRUKER, D8-Advance model, Germany) استفاده شد. الگوهای پراش با پرتو CuKα و با سرعت روبش 0058/0 درجه بر ثانیه در محدوده زاویه­ای (90–10) تهیه شدند و شناسایی الگوها با استفاده از کارت­های مرجع تشخیص فاز (JCPDS) انجام گرفت.

برای اطمینان از ایجاد پیوند بین گروه‌های عاملی ژلاتین و فلوئورهیدروکسی آپاتیت، مقادیر مشخص از هر نمونه آماده‌سازی شد و توسط طیف‌سنج مادون قرمز(FTIR, SHIMADZU, 8400S model, Japan)  با KRS-5prism  با زاویه 45 درجه استفاده شد. طیف IR در محدوده طول موج cm−1500 تا 4000  پدیدار شد.

به منظور بررسی ریزساختار پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت سنتز شده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM, Philips, XL30 model, Poland) استفاده شد. علاوه بر این از داربست­ ها و سلو ل­های اتصال یافته به داربست­ ها در بزرگنمایی­ های مختلف توسط دستگاه SEM عکس گرفته شد.

سلول استخوان ساز ردهMG-63  (بانک سلولی انستیتو پاستور، ایران) با استفاده از محیط کشت (DMEM, Gibco, Scotland) و افزودن 10 درصد سرم جنین گوساله (FCS, Seromed, Germany) به همراه آنتی بیوتیک به میزان ^IU/_ml100 پنی سیلین و ^µg/_ml100 استرپتومایسین (Sigma, USA) تکثیر گردید تا سلول برای دو نوع ارزیابی چسبندگی و رشد و تکثیر سلولی آماده گردد.

برای بررسی­ های زیست­ سازگاری و میزان بقاء سلول­ ها از آزمون عصاره ­گیری غیرمستقیم (MTT, Sigma, Saint Louis, USA) استفاده شد. همچنین شرایط محیط کشت تا حد امکان مشابه بدن، دمای 37 درجه سانتی­گراد و pH خنثی در بازه­ های زمانی 3 و 7 روز انجام شد. علاوه بر این، در این روش ابتدا عصاره ­گیری از نمونه ­های داربست انجام می­گیرد. بنابراین عصاره نمونه ­های مختلف در زمان­ های مورد نظر تهیه شد. بدین صورت که به ازای هر 5 میلی­گرم داربست، 1 سی­سی محیط کشت افزوده شد و نمونه­ ها در انکوباتور تحت رطوبت 95 درصد و گاز CO₂ 5 درصد نگه­داری شدند. سپس در فواصل زمانی 3 و 7 روز محیط خارج و به سلول ها اضافه گردید و مقدار مشخصی محیط کشت نیز به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. شرایط محیط عصاره­ گیری تا حد امکان مشابه با شرایط محیط بدن است به همین منظور ابتدا 104×1 سلول درون پلیت کشت سلولی 96 چاهکی ریخته شدند و به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند تا سلول­ ها به کف پلیت بچسبند. عصاره گرفته شده از هر نمونه به چاهک کشت افزوده و سلول ­ها به مدت 24 ساعت دیگر در مجاورت این عصاره­ها قرار گرفتند. پس از آن محیط کشت خارج شد و 100 میکرولیتر RPMI بدون رنگ به همراه 10 میکرولیتر محلول  MTTبا غلظت 12 میلی­مولار به هر چاهک وارد شد. پس از گذشت 4 ساعت محلول روی سلول­ ها خارج گشت و DMSO (D2650, Sigma, Saint Louis, USA) به آن­ها اضافه گردید تا بلورهای  بنفش رنگ ایجاد شده حل شوند. سپس مقدار غلظت ماده حل شده در DMSO، با استفاده از دستگاه الایزا ریدر(Stat Fax-2100; GMI, Inc., Miami, FL, USA) در طول موج 545 نانومتر محاسبه شد و در نهایت میزان زنده­مانی سلولی از رابطه زیر بدست آمد.چاهک دارای سلول­ های بیشتر چگالی نوری (OD) بالاتری نسبت به چاهک با سلول کمتر نشان می­ دهد. بنابراین می­توان از رابطه زیر مقدار سلول را مشخص کرد و با نمونه شاهد مقایسه نمود.

                                                                                                                                                               ODs          

رابطه (1) : -------- = درصد زنده­مانی

                                                                                                                                                               ODc

در رابطه (1)، ODsبرابر میانگین چگالی نوری هر نمونه در زمان مورد نظر و ODc برابر میانگین چگالی نوری گروه کنترل می­باشد.

سنجش فعالیت آلکالین فسفاتازی داربست­ های ساخته شده در روزهای سوم، هفتم و چهاردم بعد از کشت سلولی، بر روی داربست­ ها ارزیابی شد.  نمونه­ ها با استفاده از سونیکیت کردن در 5/0 میلی­لیتر بافر لیزکننده یکنواخت شدند و مخلوط حاصل به مدت 10 دقیقه با دورrpm  12000 در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ گردید. مواد حاصل از تخریب سلولی با 5/0 میلی­لیتر محلول بافر آلکالین مخلوط شدند. بعد از انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی­گراد به مدت 15 دقیقه، 1 میلی­لیتر سور 5/0 نرمال، جهت توقف برهم کنش به مخلوط فوق، اضافه و جذب در 405 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه­گیری شد. فعالیت آلکالین فسفاتازی بر حسب نسبت اعداد نانومول PNP تبدیل شده در دقیقه به میلی گرم پروتئین کل محاسبه شد. و نهایتاً مقدار پروتئین کل با استفاده از الیزا کیت (پارس آزمون، ایران) اندازه گیری گردید.

به منظور انجام آزمون مکانیکی دستگاه انجام آنالیز مکانیکی (Zwick/Roell, Z050 model, Germany) مورد استفاده قرار گرفت. به همین منظور داربست­ های کامپوزیتی با سنباده پرداخته شده و به صورت نمونه­ های استاندارد برای آزمون استحکام مکانیکی در آمدند. سه نمونه با درصدهای وزنی متفاوت از فلوئورهیدروکسی آپاتیت (40، 50 و 60) آماده شدند و نمودار تنش-کرنش، استحکام تسلیم، فشاری و مدول یانگ، به ترتیب رسم و اندازه گیری شدند.

برای محاسبه­ ی نسبت تورم، داربست­ های تهیه شده به مدت 24 ساعت در آب قرار گرفتند و وزن­گیری شدند.

میزان جذب آب  با توجه به فرمول زیر محاسبه گردید:

                                                                                                                                                              W_t - W_o        

رابطه (2) : -------- = میزان جذب آب

                                                                                                                                                                 W_o

با توجه به فرمول (2)،W_t  وزن داربست متورم شده در زمان­ های مشخص و W_o وزن خشک اولیه داربست می­باشد.

به منظور تحلیل نتایج حاصل از ارزیابی­ های زیستی، تجزیه و تحلیل آنالیز واریانس یک طرفه با استفاده از نرم افزار آماری SPSS انجام گرفت و نتایج بدست آمده بصورت نمودار­های ستونی در مایکروسافت اکسل 2010 رسم شدند. همچنین سطح معنی داری در آزمون­ ها 05/0 ≥Pدرنظر گرفته شد.

یافته­ ها

تصویر 3 الگوی پراش پرتو ایکس نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ژلاتین و داربست­ های کامپوزیتی ژلاتین/ فلوئورهیدروکسی آپاتیت را نشان می ­دهد. تغییرات فازی نانو پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت کلسینه شده در دمای 700 درجه سانتی­گراد به ­وسیله آزمون XRD مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به تصویر 3 اغلب قله ­های اصلی مربوط به فاز آپاتیت از جمله قله­ های (211)، (002) و (300) به وضوح دیده می­شوند. به دلیل تشابه زیاد ساختار بلوری و ابعاد واحد شبکه، همه قله ­های فلوئورآپاتیت و هیدروکسی­­آپاتیت به طور دقیق قابل تمایز از یکدیگر نیستند. نتایج نشان داد که به جز فاز آپاتیت سایر فازهای ناخواسته در ترکیب پودر تولیدی حضور ندارند. مشخص است که برخی پیک­ها با ورود یون فلوئور به ساختار آپاتیتی، به سمت زوایای بالاتر شیفت پیدا می کنند. شیفت پیک های مشخصه آپاتیت در اثر حضور یون فلوئور در ساختار آپاتیت ناشی از کاهش پارامتر شبکه a در اثر جایگزینی نسبی یون فلوئور به جای گروه ­های هیدروکسیل، که دارای شعاع یونی بزرگتری نسبت به یون فلوئور هستند، می­ باشد. علاوه بر این همانطور که در تصویر 3 قابل مشاهده است، الگوی پراش بدست آمده از داربست ­های کامپوزیتی نشان دهنده تشکیل نوعی فاز بلوری است ولی از آنجا که فاز آپاتیتی آمیخته با ژلاتین است شدت قله­ های بدست آمده نسبت به قله ­های فلوئورهیدروکسی آپاتیت پایین هستند. بررسی قله ­های ثبت شده در مقایسه با کارت­ های XRD مربوط به ترکیبات کلسیم فسفاتی موجود در پایگاه داده ­ای ICDD و استفاده از نرم­افزار شناسایی فاز­ها که قله­ های بدست آمده را با اطلاعات ثبت شده برای ترکیبات مختلف مقایسه کرده و تحلیل می ­کند، اثبات کرد که فازهای تشکیل شده در داربست از نوع آپاتیتی، مخصوصا فلوئورهیدروکسی آپاتیت است. یک پیک وسیع تپه مانند در الگوی پراش ژلاتین در ناحیه 20=θ2 نیز قابل مشاهده است که نشان دهنده­ ساختار کریستالی مارپیچ سه تایی در ژلاتین است و شبیه کلاژن نیز می­باشد.^(24و23)

تصویر 3 : الگوی پراش پرتو ایکس نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، داربست­های کامپوزیتی و ژلاتین

در تصویر 4 نتایج آزمون FTIR برای نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ژلاتین و داربست های کامپوزیتی با درصدهای مختلفی از فلوئورهیدروکسی آپاتیت (40 درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت، 50 درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت و 60 درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت) نمایش داده شده است. با توجه به طیف بدست آمده از پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، پیک اضافه­ ای که بیان کننده جایگزینی گروه ­های عاملی ناخواسته در ترکیب آپاتیت یا حضور ناخالصی­ ها باشد، وجود ندارد. در فلوئورهیدروکسی آپاتیت سنتز شده ساختار آپاتیت با طول موج­ های cm^-1610-560 و cm^-11100-950 مشاهده می­ شود. همچنین یک پیک کوچک در طول موج  cm^-1960 که مربوط به باند فسفاتی ساختار آپاتیت است در ساختار فلوئورهیدروکسی آپاتیت دیده می­شود. در واقع آنچه ساختار هیدروکسی آپاتیت را از فلوئورهیدروکسی آپاتیت متمایز می­کند، باند­های مرتبط با گروه­ های هیدروکسیل شبکه ­ای در طول موج­ های cm^-1633 و cm^-13570 می­ باشد. چهار پیک مرتبط با ارتعاشات V₁، V₂، V₃ و V₄ از گروه­ های فسفاتی در ترکیب آپاتیت به روشنی قابل تشخیص هستند. پیک ­های مرتبط با ارتعاشات V_{1 و} V₂به ترتیب در cm^-1961 و  cm^-1 454 ظاهر شده ­اند. پیک مشاهده شده در موقعیت cm^-1 745 مشخصه زنجیر هیدروکسیلی است که در ساختار آپاتیت، غنی از فلوئور شده و تاییدی است بر جایگزین شدن کامل گروه­ های هیدروکسیل در ساختار آپاتیت با یون فلوئور که در نتایج سایر پژوهش­ ها نیز حضور این پیک گزارش شده است. ارتعاش V₃از  ارتعاشات مربوط به گروه ­های فسفاتی، که شدیدترین ارتعاش موجود در میان ارتعاشات معرف فسفات در ترکیب آپاتیت است، نیز در محدوده طول موج  cm^-1 1100-1000 به صورت یک پیک گسترده با شدت بالا مشاهده شد. با توجه به طیف سنجی مادون قرمز داربست­ های کامپوزیتی دسته­ای از اعداد موجی (1450، 1540، 1650) که شاخص ترین آنها مربوط به آمید نوع اول و دوم است، ناشی از حضور ژلاتین بوده و اعداد موجی (cm-1 560، 1040) مربوط به باند­های ارتوفسفات نیز حاکی از شکل­گیری رسوب آپاتیتی در میان ژلاتین است. ظهور قله در عدد موجی 1345 چنانکه در منابع دیگر هم بیان شده است، به علت شکل گیری پیوند مابین گروه­ های کربوکسیل از ژلاتین و یون کلسیم از آپاتیت می­باشد. همانطور که در طیف سنجی مادون قرمز ژلاتین مشاهده می­ شود، باند موجود در ناحیه cm^-1 3457 مربوط به حضور آب و آمید A می­باشد. پیک­ های موجود در 1657، 1544 و cm^-1 1236 به ترتیب مربوط به آمید I، آمید II و آمید III می­ باشند. علاوه بر این پیک ­های موجود در محدوده 1350 تا cm^-1 1480 مربوط به باند ارتعاشی گروه متیل می­باشند.^(27-25)

تصویر 4 :طیف­های مادون قرمز نانوذرات نانوپودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ژلاتین و داربست­های کامپوزیتی

تحقیقات در زمینه مهندسی بافت نشان داده است که محدوده تخلخل بهینه برای مهندسی بافت استخوان برابر با 300-100 میکرومتر است. تحقیقات انجام شده و داده ­های حاصل از اندازه حفرات و پراکندگی آن­ها بیانگر این موضوع است که داربست­ها برای کابردهای مهندسی بافت استخوان مناسب می­باشند. تصاویر بدست آمده از سطح کامپوزیت­­­ها، نشان دهنده­ی وجود تخلخل بالا با حفره ­های منظم، مشابه ساختار لانه زنبوری و تقریبا هم اندازه در کنار یکدیگر و مرتبط باهم هستند. قطر تخلخل­ها در بازه 100 تا 350 میکرومتر قرار می­گیرد. تصویر 6 تصاویر SEM از پودر­ فلوئورهیدروکسی آپاتیت را نشان می­ دهد. در این تصویر مشاهده می­ شود که ذرات تشکیل شده ­اند و کروی شکل هستند و در بعضی نقاط حالت توده ­ای پیدا کرده­اند. نتایج بدست­آمده از تصاویرSEM  در تصویر 5 و 7 و آنالیز داده ­ها با استفاده از نرم­افزار Image J نشان می­ دهد که در داربست با بیشترین درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت میانگین قطر تخلخل برابر با 3/31±58/81 میکرومتر است. همان­طور که در شکل مشاهده می­ گردد با افزایش درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت در ساختار داربست­، میانگین اندازه قطر تخلخل کاهش یافته است.­ علاوه بر این می­توان دریافت که علت کاهش درصد تخلخل با افزایش میزان فلوئورهیدروکسی آپاتیت به ماهیت و چگونگی ایجاد تخلخل­ ها و تمایل ذاتی ژلاتین به اسفنجی شدن خودبه خودی در اثر انحلال در آب بر می­گردد. میانگین اندازه قطر تخلخل در داربست 50 درصد وزنی  FHAو 40 درصد وزنی FHA  به ترتیب برابر 48/34±99/94 و 54/58±75/180 میکرومتر است، هم­چنین پراکندگی اندازه تخلخل ها روی نمودار تصویر 7 نشان می­ دهد که با افزایش میزان فلوئورهیدروکسی آپاتیت در ساختار داربست­ ها، توزیع تخلخل­ ها به­سمت تخلخل­ های ریز­تر نیز می­رود. تصاویر SEM موید وجود مسیرهای ارتباطی مابین حفره­ های ایجاد شده می ­باشند و در مجموع با توجه به بازه اندازه تخلخل­ ها و ارتباط حفره­ ها به یکدیگر می­توان گفت داربست­ های کامپوزیتی بدست آمده از این نظر، تا حد زیادی خصوصیات یک داربست مطلوب مورد استفاده در مهندسی بافت استخوان را دارند.

علاوه بر این مورفولوژی سلول ­ها پس از قرارگیری داربست ها به مدت 7 روز در محیط کشت در تصویر 8 نشان داده شده است. همانطور که در تمامی نمونه ­ها دیده می­ شود سلول­ ها بوسیله پایک­ های کاذب به درون تخلخل ­ها نفوذ کرده و به سطح داربست چسبیده ­اند و تشکیل لای ه­ای سلولی را داده­اند.

تصویر 5 : تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی داربست­های کامپوزیتی. الف و ب به ترتیب مربوط به تصاویر مقاطع افقی و عمودی داربست­ها می­باشند. ج و د نیز مربوط به مقاطع مشخصی از داربست­های کامپوزیتی می­باشند

تصویر 6 : تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از نانو پودر فلوئورهیدروکسی آپاتیت کلسینه شده در دمای 700 درجه سانتی­گراد

تصویر 7 : نمودار توزیع قطر تخلخل و تصاویر SEM از داربست­ها. الف) 40 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ب) 50 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت و ج) 60 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت

تصویر 8 : تصاویر SEM چسبندگی سلول­ها بر داربست­های: الف) 60 درصد وزنی FHA، ب) 50 درصد وزنی FHA و ج) 40 درصد وزنی FHA

نمودار 1 میزان بقای سلولی برای نمونه ­های مختلف را با آزمون اندازه ­گیری میزان سمیت سلولی با روش غیرمستقیم در مقایسه با نمونه کنترل (C) و در زمان­های مختلف نشان م ی­دهد. همان­طور که مشاهده می­شود، زنده­مانی همه داربست­ها بالای 90 درصد می­باشد و با افزایش درصد فلوئورهیدروکسی آپاتیت در ساختار داربست، میزان زنده­ مانی افزایش یافته است. این نتایج نشان­ دهنده زیست­ سازگاری داربست­ های ساخته شده می­باشد و می­توان گفت که این داربست­ها هیچ اثر سمیتی روی سلول­های MG-63 ندارند.  تصاویر SEM و نتایج عصاره ­گیری نشان می­دهند که داربست­ های کامپوزیتی ساخته شده با درصدهای مختلف آپاتیت زیست­ سازگارند و مناسب برای کاربردهای مهندسی بافت استخوان می­ باشند. لازم به ذکر است که مقدار P-value برای مقادیر بدست آمده کمتر از 05/0 بود که نشان دهنده ­ی معنی دار بودن داده ­های بدست آمده است.

آلکالین فسفاتاز، یک اکتوآنزیم است که به وسیله سلول­ های استئوبلاست تولید می­ شود. برخی معتقدند که این آنزیم در تخریب پیروفسفات معدنی مشارکت می­ کند تا یک غلظت موضعی کافی از فسفات یا پیروفسفات معدنی، به منظور فرآیند معدنی شدن، فراهم نماید. در میان آزمون­ های بیولوژیکی مختلف برای تخمین میزان فعالیت استئوبلاست­ها درون داربست ها، ترشح آلکالین فسفاتاز، آزمونی مهم است. فعالیت آلکالین فسفاتازی سلول ­های استئوبلاست کشت شده بر روی داربست های کامپوزیتی ساخته شده از ژلاتین وفلوئور هیدروکسی آپاتیت، با سه نسبت مختلف فلوئورهیدروکسی آپاتیت، در روزهای سوم، هفتم و چهاردهم کشت سلولی در نمودار 2 قابل مشاهده است.

بر اساس نمودار، فعالیت آلکالین فسفاتازی بین روز سوم، هفتم و چهاردهم از تفاوت معنی داری برخوردار است. تفاوت چشمگیر در فعالیت آلکالین فسفاتاز در داربست­ ها، می­ تواند به این علت باشد که در داربست­ با غلظت­ های بالاتر فلوئورهیدروکسی آپاتیت چسبندگی و تکثیر سلول­ ها بر روی داربست ­ها افزایش می­یابد.

نمودار 1 : نتایج آزمون MTT برای داربست­های کامپوزیتی ژلاتین- فلوئورهیدروکسی آپاتیت با نسبت­های مختلف از فلوئورهیدروکسی آپاتیت بعد از سه و هفت روز (05/0*P≤)

نمودار 2 : فعالیت آلکالین فسفاتازی سلول­های استئوبلاست کشت شده بر روی داربست­های کامپوزیتی ژلاتین - فلوئورهیدروکسی آپاتیت با نسبت­های مختلف فلوئورهیدروکسی آپاتیت در روزهای سوم، هفتم و چهارهم بعد از کشت سلولی (05/0*P≤)

سه نوع نمونه برای بررسی خواص مکانیکی داربست­ ها آماده شد و نمودار نیرو بر حسب جابه­ جایی هر نمونه بدست آمد و با استفاده از آن، مقادیر تنش و کرنش در هر لحظه محاسبه و نمودار تنش برحسب کرنش برای هر سه نمونه ترسیم شد. تصاویر 11-الف تا 11-ج، نیز نمودار تنش-کرنش هر سه نمونه را نشان می ­دهند. نمودار شامل سه قسمت الاستیک، پلاستیک و فشردگی است. با توجه به تصویر 11 قسمت الاستیک برای هر سه نمونه، ناحیه قبل از نقطه تسلیم می­ باشد که تنش و کرنش با یکدیگر تا حدودی رابطه خطی دارند و با توجه به این ناحیه مدول یانگ برای نمونه­ ها محاسبه گردید. همانطور که در تصویر 11 قابل مشاهده است ناحیه پلاستیک برای هر سه نمونه در محدوده نقطه تسلیم تا ایجاد فشردگی و شکست در نمونه ­ها واقع شده است. منظور از قسمت فشردگی قسمتی است که در آن افزایش مجدد تنش پس از له شدگی نمونه رخ می­ دهد. در واقع این قسمت به علت وقوع شکست در ساختار متخلخل داربست بوجود آمده است که با افزایش تنش حفره­ های داربست به تدریج پر شده و کرنش افزایش یافته است و این افزایش تا زمانی ادامه پیدا می­ کند که تمامی حفره­ ها پر شده و داربست به یک سازه توپر تبدیل شود و پس از آن تنش به طور ناگهانی افزایش می ­یابد.⁽²⁸⁾

تصویر 11 : نمودار تنش-کرنش داربست­های کامپوزیتی (الف- 60 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت، ب-50 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت و ج- 40 درصد وزنی فلوئورهیدروکسی آپاتیت)

همچنین مدول یانگ داربست­های کامپوزیتی در ناحیه الاستیک با استفاده از معادله 3 محاسبه شد.

       s  

رابطه (3) : ------E=

       e

در معادله فوق E مدول یانگ، sتنش و eکرنش اعمالی به هر کدام از داربست­های کامپوزیتی می­باشد.

مدول یانگ و استحکام تسلیم به طور میانگین برای نمونه­ ها 40 و 7 مگاپاسکال بدست آمد. این مقادیر چند برابر مقادیر گزارش شده در داربست­ های مشابه است.⁽²⁹⁾ در واقع علت این تفاوت، تشکیل بلورهای آپاتیت در ساختار داربست است. علاوه بر این تشکیل بلورهای آپاتیت باعث افزایش سطح آزاد و در نتیجه افزایش ناحیه تماس فاز تقویت کننده با فاز زمینه شده و استحکام مکانیکی آن­ها را چند برابر می­سازد. همچنین با توجه به نتایج حاصل از طیف سنجی فروسرخ، وجود نوعی پیوند شیمیایی بین فلوئورهیدروکسی آپاتیت و ژلاتین که موجب تقویت خواص مکانیکی کامپوزیت شده است قابل تایید است که این مکانیزم در داربست­ های مشابه گزارش نشده است.⁽³⁰⁾ نهایتا با مقایسه این داده ­ها می­ توان دریافت که با افزایش میزان فلوئورهیدروکسی آپاتیت در ساختار داربست ­ها خواص مکانیکی نیز مانند خواص بیولوژیکی بهبود یافته است.

جدول 2 : مدول یانگ داربست ساخته شده در این پژوهش در مقایسه با استخوان اسفنجی، استخوان فشرده و یک داربست دیگر