Detection of Human Papillomavirus (HPV) in Ameloblastoma Using the Polymerase Chain Reaction (PCR)

Document Type : original article

Authors

1 Associate Professor, Department of Oral & Maxillofacial Pathology, School of Dentistry, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran.

2 PhD Genetics, Department of Oral & Maxillofacial Pathology, Faculty of Dentistry, Mashhad, Iran 3 Dental student, Faculty of Dentistry, Mashhad, Iran

3 Dental student, Faculty of Dentistry, Mashhad, Iran

Abstract

Introduction: Ameloblastoma is a prevalent odontogenic maxillofacial tumor. Human papillomavirus (HPV) is considered to be one of the main risk factors for ameloblastoma. The current research aimed to investigate the presence of HPV in the ameloblastoma of jaw samples using the polymerase chain reaction (PCR).
Materials and Methods: This study was conducted on 77 formalin-fixed and paraffin-embedded tissue blocks, which were obtained from the archives of the Department of Pathology at Mashhad Dentistry School and Ghaem Hospital in Mashhad, Iran. Deparaffinization and DNA extraction in the samples were performed in accordance with the instructions of the YTA genomic DNA extraction mini kit. After PCR, the presence of HPV was evaluated in the samples. Data analysis was performed in SPSS version 16 using descriptive statistic (frequency distribution tables and charts), Chi-square, and logistic regression.
Results: Among 77 lesions, 20 cases were follicular, four cases were acanthomatous, three cases were basal cells, eight cases were desmoblastic, 17 cases were unicystic, and 25 cases were plexiform. Moreover, five samples (6.5%) were positive for HPV. HPV was detected in one follicular case, two unicystic cases, and two plexiform cases.
Conclusion: Considering the low prevalence of HPV in the examined lesions, it could not be concluded that the virus was involved in the etiology and pathogenesis of the lesions. Therefore, further investigations must be conducted on larger sample sizes for more accurate results.

Keywords

Main Subjects


مقدمه

آملوبلاستوما یک تومور اپی تلیالی ادنتوژنیک فک است که از بقایای اپی‏تلیال ‏مالاسز یا سایر عناصر اپی‏تلیالی ‏مینایی در حال تشکیل به وجود می‏آید. معمولاً خوش خیم می‏باشد. دارای رشد مهاجم است و یکی از شایع ترین تومورهای ادونتوژنیک ناحیه فک و صورت می‏باشد که به آهستگی رشد می‏کند. به صورت لوکالیزه یک نئوپلاسم مهاجم بوده و در دهه‏های سوم تا چهارم زندگی و در مردان شایعتر می‏باشد. این تومور تمایل زیادی به عود دارد. یکی از علائم اصلی این بیماری، تورم (Swelling) و درد ناحیه فک می‏باشد که به تدریج بر شدت آن افزوده می‏شود ولی بطور کلی بدون علائم می‏باشد.(1)

بر اساس اطلاعات موجود علت بروز این نئوپلاسم می‏تواند ضربه به فک، راشیتیسم، کشیدن دندان، استعمال مواد مخدر و اعتیاد به سیگار باشد. در مقالات جدید HPV نیز به عنوان یک فاکتور اتیولوژیک مورد توجه قرار گرفته است.(2)

ویروس پاپیلومای انسانی (Human Papilloma Virus)، ویروسی کوچک با DNA دو رشته‏ای می‏باشد و بطور معمول در بافت های اپیتلیوم زندگی کرده و سبب افزایش تکثیر این دسته از سلول ها می‏شود. این عقیده وجود دارد که ویروس HPV در هنگام تروما و ضربه‏های خفیف وارد بافت اپیتلیوم شده و برای تکثیر در این ناحیه باقی می‏ماند.(3)

تاکنون بیش از 100 نوع ژنوتایپ از ویروس HPV شناخته شده است که تنها گروه کوچکی از آنها باعث ایجاد تومور در بافت های اپیتلیوم نقاط مختلف بدن می‏شوند.

HPV نوع 16 و 18 ریسک بالای ابتلا به سرطان دارند. این ویروس مسئول ضایعات صورتی و دهانی متعدد در بیماران دارای سیستم ایمنی سالم می‏باشد. شایع ترین شکل آن Oral Squamous Papilloma و Verruca Vulgaris (common wart) می‏باشد. افزایش شیوع ضایعات مربوط به HPV در بیماران مبتلا به HIV دیده شده است. شایعترین محل درگیری آن، نواحی دهانی تناسلی (Orogenital) می‏باشد و ممکن است درگیری دهان نیز دیده شود. در ضایعات داخل دهانی ممکن است انواع HPV دیده شود اما در افراد مبتلا به HIV اغلب انواع غیرمعمول تر آن نظیر HPV-7 (در رابطه با Butcher warts) یا HPV-32 (اغلب در Hecks Disease) دیده می‏شود.(5و4)

معمولا ضایعات دهانی HPV متعدد هستند و ممکن است روی هر سطح مخاطی ایجاد شود. شایع ترین محل های درگیر، مخاط لبیال، مخاط باکال و لثه‏ها هستند. دیسپلازی در ضایعات وابسته به HPV در بیماران مبتلا به ایدز دیده می‏شود. بنابراین بررسی دقیق بیماران از نظر ایجاد کارسینوم سلول سنگفرشی (SCC) ضروری می‏باشد. درمان انتخابی این اختلال، جراحی و خارج کردن ضایعه است اما عود آن به خصوص در بیمارانی که نقص شدید سیستم ایمنی دارند، شایع است.(6) با اینکه اطلاعات قابل توجهی در رابطه با نقش اتیولوژیک HPV در طیف گسترده‏ای از تومورهای خوش خیم و بدخیم به دست آمده است، اما دانسته‏های ما درباره­ی رابطه­ی HPV و تومورهای دهانی و آملوبلاستوما اندک می‏باشد.(7) همچنین مطالعات اندکی در رابطه با اتیولوژی ژن‏های HPV در تومور دهانی به خصوص در نژاد ایرانی انجام شده است. هدف ما در این مطالعه، بررسی HPV در نمونه‏های تومور آملوبلاستومای فکین با استفاده از روش PCR بود.

مواد و روش‏ها

این مطالعه بر روی بلوک های پارافینه افراد مبتلا به آملوبلاستوما در آرشیو بخش پاتولوژی دهان، فک و صورت دانشکده دندانپزشکی مشهد و بیمارستان قائم (عج) دانشگاه علوم پزشکی مشهد، انجام شد. روش نمونه گیری به صورت غیر احتمالی و مبتنی بر هدف بود.

معیارهای ورود به این مطالعه شامل تأیید تشخیص پاتولوژی توسط دو پاتولوژیست و کافی بودن میزان ضایعه در بلوک‏های پارافینی جهت استخراج DNA بود. معیارهای خروج ازاین مطالعه شامل عدم تایید کیفیت بلوک پارافینه، کیفیت پایین DNA استخراج شده از بافت و نداشتن پرونده پیگیری کامل بود.

 با توجه به این که بررسی افراد با این بیماری‏ها نیازمند زمان طولانی می باشد، لذا در این مطالعه از بلوک‏های پارافینی مربوط به ضایعاتی که در سایر مطالعات مورد بررسی قرار داده شده و نتایج آن بر اساس یافته‏های بالینی هیستولوژیک کاملاً تایید شد، استفاده گردید. به این ترتیب 77 نمونه مبتلا به آملوبلاستوما که در فرمالین فیکس شده و پارافینیزه بودند و در بخش پاتولوژی دهان، فک و صورت دانشکده دندانپزشکی مشهد و بیمارستان قائم (عج) دانشگاه علوم پزشکی مشهد، نگهداری می‏شدند، انتخاب شدند. به هر بلوک پارافینی بدون ذکر نام و مشخصات بیماران، یک شماره داده شد و فرد عمل کننده نیز از نوع ضایعه هر بلوک بی اطلاع بود.

از هر بلوک پارافینی تحت شرایط کاملا استریل و توسط وسایلی که از قبل اتوکلاو شده بودند، مقاطع مورد نظر توسط میکروتوم Leitz 1512 ,Germany)) زیر هود بیولوژیک، تهیه گردید. از مقطع اول با ضخامت 4 میکرون برای رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین و از مقاطع دیگر با ضخامت 5 میکرون، جهت استخراج DNA استفاده گردید.

 ابتدا مقاطع پارافینه‏ای که در میکروتیوب استریل قرار گرفته بود توسط روش گزیلول/ اتانول پارافین زدایی گردید. سپس با سانتریفیوژ با 3000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه، بافت خالص رسوب کرده و بقیه مراحل استخراج DNA بر روی رسوب حاصل انجام شد. سپس لیز سلولی، حذف پروتئین و آزاد شدن DNA از این نمونه با استفاده از کیت (YTA, Iran)Genomic DNA extraction mini kit براساس دستور کارخانه سازنده استخراج گردید.توسط دستگاه نانودراپ DNA حاصل از استخراج، برای تشخیص کیفیت و میزان خلوص و غلظت DNA تخلیص شده استفاده گردید.

جهت تشخیص ویروس HPV توسط پرایمرهای MY09 و MY11، واکنش PCR انجام شد که ژن β گلوبین (PCO3/PCO4) به عنوان ژن Housekeeping و کنترل داخلی برای ارزیابی صحت انجام واکنش PCR، مورد استفاده قرار گرفت. پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه جهت تشخیص 20 ژنوتیپ HPV شامل انواع 6، 11، 13، 16، 18، 30، 31، 32، 33، 35، 39، 40، 43، 45، 51، 54، 55، 56، 59 و 66 ویروس مورد استفاده قرار گرفت. سکانس پرایمرها در جدول 1 موجود می‏باشد.

با کمک پرایمر‏های اختصاصی که در جدول 1 نشان داده شده است در دستگاه ترموسایکلر PCR(ABI, USA) طی 35 سیکل و تحت شرایط دمایی زیر °C95 به مدت 1 دقیقه، C° 56 به مدت 30 ثانیه و C° 72 به مدت 1 دقیقه، واکنش PCR انجام شد.

پس از فرایند PCR، قطعات DNA بر اساس اندازه جداسازی شدند. محصولات تکثیر شده به وسیله PCR با استفاده از ژل آگاروز تحت الکتروفورز قرار گرفتند. نمونه‏ها در ژل آگاروز 2 درصد و تحت ولتاژ V 100 الکتروفورز شدند و با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شدند. ژل الکتروفورز در زیر نور ماورا بنفش (UV) مورد مشاهده قرار گرفت. نمونه‏های کنترل مثبت 2 باند داشتند. باند کنترل داخلی که  bp250 است و باند HPV که bp450 می‏باشد. وجود یک باند bp250، نشان دهنده ی کیفیت خوب DNA استخراج شده و همچنین صحت انجام آزمایش PCR در نمونه بود، ولی در این بیماران ویروس HPV منفی بود. بیماران دارای HPV، دارای هر دو باند بودند. (شکل 1)

در نهایت داده‏ها وارد نرم افزار آماری SPSS با ویرایش 16 شدند و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند با استفاده از آزمون آماری کای اسکوئر مقایسه شدند. در نهایت جهت تعیین رابطه بین متغیرهای زمینه‏ای نمونه‏های بیوپسی با متغیرهای اصلی از آزمون کای اسکوئر و رگرسیون لوجستیک استفاده شد.

 

جدول 1 : توالی DNA پرایمرهای HPV (MY09/MY11) و ژن β  گلوبین (PC03/PCO4)

M=A or C; R=A or G; W=A or T; Y=C or T

Sequence

Primer

5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3'

MY09 (Forward)

5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3'

MY11 (Reverse)

5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3'

PC03 (Forward)

5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'

PC04 (Reverse)


NC                    L                       1                       2                       PC                    3                     4   

 

عکس مقاله دکتر زارع

تصویر 1 : تصویر ژل الکتروفورز در زیر نور ماورا بنفش. ردیف های 1 و 2 بیماران دارای HPV و ردیف‏های 3و 4 بیماران HPV منفی هستند. PC: Positive Control و NC: Negative Control و L: Ladder 50 bp


یافته ‏ها

در مطالعه حاضر در مجموع 77 ضایعه موجود در آرشیو بخش پاتولوژی دهان و فک و صورت دانشکده دندانپزشکی مشهد و بیمارستان قائم مشهد مورد مطالعه قرار گرفت که از این تعداد 5 مورد (5/6 درصد) از نظر HPV مثبت بود. این موارد به تفکیک نوع آملوبلاستوما در جدول 2 آمده است.

نوع فولیکولار که یک مورد آن از نظر HPV مثبت شده بود، مربوط به یک مرد بود. در نوع یونی سیستیک، یک مورد مرد و یک مورد زن از نظر HPV مثبت شده بود. در نوع پلکسی فرم نیز یک نفر مرد و یک نفر زن از این نظر مثبت شده بود. توزیع فراوانی نوع آملوبلاستوما بر حسب جنس در نمودار 1 نشان داده شده است که بیشترین موارد با ابتلای 16 مرد و 9 زن مربوط به نوع پلکسی فرم بوده است.

میانگین سن و انحراف معیار افراد مبتلا به آملوبلاستوما در گروه‏های مورد مطالعه در نوع فولیکولار 70/20±39، در اکانتوماتوز 11/12±43، در نوع بازال سل 61/35±21، در نوع دسموپلاستیک 38/18±50، در سیستیک 90/7±20 و در نوع پلکسی فرم 25/17±25 سال بود.

نتیجه آزمون آماری کای اسکوئر نیز نشان داد بین جنس و مثبت شدن HPV ارتباط آماری معنی داری وجود داشت (045/0=P). به این صورت که از پنج فرد مبتلا به HPV در این مطالعه، 3 نفر (60 درصد) مرد و 2 نفر (40 درصد) زن بودند.

 نتیجه رگرسیون لوجستیک Binary نشان داد که بین سن و مثبت شدن HPV ارتباط آماری معنی‏دار وجود نداشت (326/0=P).

 

جدول 2 : توزیع فراوانی موارد مثبت HPV بر حسب نوع آملوبلاستوما

نوع آملوبلاستوما

تعداد

درصد

فولیکولار

HPV مثبت

1

0/5

HPV منفی

19

0/95

اکانتوماتوز

HPV مثبت

-

-

HPV منفی

4

0/100

بازال سل

HPV مثبت

-

-

HPV منفی

5

0/100

دسموبلاستیک

HPV مثبت

-

-

HPV منفی

6

0/100

یونی سیستیک

HPV مثبت

2

8/11

HPV منفی

15

2/88

پلکسی فرم

HPV مثبت

2

0/8

HPV منفی

23

0/92

کل

HPV مثبت

5

5/6

HPV منفی

72

5/93

 


نمودار 1 : توزیع فراوانی نوع آملوبلاستوما بر حسب جنس

 بحث

نتایج مطالعه حاضر نشان داد ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) در آملوبلاستوما به روش PCR قابل ردیابی است، خصوصا اگر آملوبلاستوما از نوع یونی سیستیک، پلکسی فرم و یا فولیکولار باشد. انواع 16و 18 HPV به عنوان سرطانزاهای پر خطر، انواع 31، 33، 35، 39، 45، 51، 52 و 56 به عنوان پرخطر با شیوع کمتر و انواع 6 و 11 در گروه کم خطر طبقه بندی می‏شوند و دارای توالی موتیف‏های حفظ شده‏ای هستند که در همه ژنوتیپ‏های شناخته شده حضور دارند. این عناصر می‏توانند با یک Consensus primer، به عنوان هدف استفاده شوند و محصول PCR تولید کنند که نوع HPV موجود در آن مهم نباشد. یک امتیاز جالب PCR با دامنه ی وسیع این است که تمام انواع HPV می‏توانند در یک PCR منفرد غربالگری شوند که موجب حفظ زمان و مواد می‏شود. همچنین ژنوتیپ‏های جدید HPV، بدون اینکه نیاز به تغییر پروتکل PCR باشد، می‏توانند شناسایی شوند.(8)

اگرچه HPV با تعدادی از ضایعات پرولیفراتیو اپی‏تلیالی از جمله بدخیمی‏های سلول سنگفرشی در ارتباط است، این ویروس در 20-10 درصد مخاط دهانی نرمال جمعیت بالغ یافت می‏شود. منطقه ورود و ناحیه تکثیر HPVدر حفره دهان ناشناخته است. از آنجا که پاکت‏های لثه‏ای تنها نقطه‏ای از مخاط دهان هستند که سلول‏های بازال (به عنوان سلول‏های هدف ویروس) به محیط اکسپوز هستند، این طور فرض شده که این ناحیه محل نهفتگی ویروس HPV است.(9)

اولین مطالعه پیرامون ارتباط HPV با آملوبلاستوما توسط Kahn صورت گرفت و حضور ویروس در آملوبلاستومای افراد جوان شرح داده شد. از 38 مورد از نمونه‏های آملوبلاستوما در افراد زیر 20 سال، 10 نمونه برای بررسی وجود HPV با استفاده از آنالیز ایمونوهیستوشیمی مورد بررسی قرار گرفتند. 3 نمونه از این 10 مورد از لحاظ وجود HPV مثبت بودند در حالی که هیچ یک از نمونه‏های آملوبلاستوما در بالغین مسن تر مثبت نبود.(10)

در مطالعه حاضر 5 مورد (5/6 درصد موارد) از 77 نمونه بررسی شده از لحاظ HPV مثبت بودند. ولی Riderو همکاران(11) در مطالعه ی خود بر روی 20 کیست رادیکولار پس از اعمال آنتی بادی پلی کلونال و پروسه‏های رنگ آمیزی ایمنوفلورسانس مشاهده کردند که تمامی 20 نمونه آزمایش شده برای حضور HPV منفی بودند. آنها نتیجه گرفتند که در نمونه‏های کیست رادیکولار، بافت گرانولیشن می‏تواند به تنهایی منبع تامین فاکتورهای رشدی و تاثیر بر تکثیر بقایای اپی تلیالی مالاسز باشد و HPV در آن دخیل نمی‏باشد. ولی در مطالعه‏ای دیگر عنوان شده است که پاپیلوماویروس می‏تواند به بزاق ریخته شود و این احتمال وجود دارد که این ویروس‏ها از طریق اکسپوژرهای کرونال به بافت پالپی و پری رادیکولار دسترسی داشته باشند.(12)

HPV می‏تواند به عنوان منبع احتمالی التهاب فولیکول دندانی عمل کند و یا از طریق مسیرهایی فولیکول ملتهب را آلوده کند، چرا که رابطه میان التهاب مزمن و عفونت HPV از لحاظ بیولوژیک امکان پذیر است و با بسیاری مطالعات مولکولی و اپیدمیولوژیک مورد حمایت قرار گرفته است.

Xuan و همکاران(13)در مطالعه ای، رابطه میان بروز ژن (Sonic Hedgehog (SHH و عفونت HPV-16 را در سرطان سرویکس رحم نشان داد. با توجه به این مطلب که مولکول‏های سیگنال دهنده SHH در آملوبلاستوما نشان داده شده اند، می‏توان نتیجه گرفت که HPV در بروز این ضایعه می‏تواند ایفای نقش کند.(15و14)

در مطالعه ی حاضر از پرایمرهای GP5+/GP6+ استفاده شد که بسیار حساس هستند و حتی در نمونه‏های با بار میکروبی بسیار پایین مثبت می‏شوند. این پرایمرها قادر به شناسایی توالی بسیار کوتاه از DNA ویروس در نمونه‏های فیکس شده می‏باشند که این موضوع منجر به حساسیت بسیار بالای این پرایمرها می‏شود. علی رغم این که طی پروسه فیکس شدن DNA به قطعات بسیار کوچک شکسته می‏شوند، اما این پرایمرها هم چنان قادر به شناسایی آن‏ها می‏باشند.(16)

مطالعاتی که از روش‏های ایمونوهیستوشیمی یا پرایمرهای مختلف جهت تشخیص HPV استفاده کرده اند، حساسیت‏های متفاوتی نسبت به تشخیص این ویروس دارند. پرایمرهای GP5+/GP6+ قادر به تشخیص 20 ژنوتیپ HPV شامل انواع 6، 11، 13، 16، 18، 30، 31، 32، 33، 35، 39، 40، 43، 45، 51، 54، 55، 56، 59 و 66 می‏باشند که این ژنوتیپ‏ها 5 تا از 6 ژنوتیپ تشخیص داده شده در مطالعات قبلی بر روی تومورهای ادنتوژنیک بودند.(19-17) در صورتی که برخی پرایمرهای مورد استفاده در مطالعات، قادر به شناسایی ژنوتیپ‏های محدودی از HPV می‏باشند(17) شاید حساسیت تکنیک‏های آزمایشگاهی یکی از عوامل موثر در گزارش فراوانی بالاتر HPV در مطالعه ی ما نسبت به مطالعاتی که ویروس را در ضایعات شناسایی نکرده بودند، باشد.

جراحی پذیرفته شده ترین درمان در رابطه با بسیاری از کیست‏ها و تومورهای ادونتوژنیک است. ولی به هر حال نقایص به جا مانده و همچنین عودهای مکرر از عوارض جراحی این ضایعات است که به خصوص در مورد ضایعات مهاجم تر مثل آملوبلاستوما مطرح می‏باشد.(20) بنابراین در صورت تائید نقش ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) در این دسته از ضایعات، می‏توان درمان‏های ضد ویروسی را به عنوان یکی از گزینه‏های درمانی جدید جهت کنترل این ضایعات مطرح کرد.(21) ولی مطالعات بیشتری با حجم نمونه ی بالاتر و بررسی دقیق تر ژنوتیپ‏های ویروس و اندازه گیری کمیت DNA ویروسی (بار ویروس) برای روشن شدن نقش HPV در ایجاد کیست‏ها و تومورهای ادونتوژنیک لازم می‏باشد که امید است در آینده مورد توجه پژوهشگران قرار بگیرد.

فراوانی HPV در آملوبلاستوما می‏تواند بیانگر این موضوع باشد که حضور این ویروس می‏تواند باعث ایجاد کیست‏های ادونتوژنیک یا تغییرات تومورال در آن‏ها شود ولی به هر حال با توجه به محدودیت‏های مطالعه ی ما از جمله حجم پایین نمونه نمی‏توان با اطمینان در رابطه با چنین نتیجه‏ای اظهار نظر کرد. هم چنین برای بررسی‏های دقیق تر بهتر است که سروتایپ‏های اختصاصی ویروس نیز در مطالعات بعدی بررسی شوند. ایمونوهیستوشیمی نیز یکی دیگر از روش‏های تشخیص وجود HPV در نمونه‏های بافتی می‏باشد که علی رغم حساسیت پایین تر آن نسبت به PCR در تشخیص ویروس، به دلیل مشخص کردن جایگاه‏های وجود ویروس در نمونه بافتی می‏تواند اطلاعات دقیق تری را فراهم نماید. لذا پیشنهاد می‏شود در مطالعات آینده علاوه بر روش PCR از روش‏های تکمیلی برای تعیین زیرگروه‏های HPV، بار ویروس و تشخیص ویروس در این ضایعات از ایمونوهیستوشیمی نیز استفاده گردد.

همچنین تحقیقات بیشتری بر روی درمان‏های ضدویروسی و اقدامات پیشگیرانه (واکسن HPV) به عنوان یکی از گزینه‏های جدید روش‏های غیرجراحی در پیشگیری و درمان این ضایعات صورت گیرد.

نتیجه گیری

یافته‏ های مطالعه ی ما نشان داد فراوانی HPV در آملوبلاستومای نوع یونی سیستیک و پلکسی فرم شایع تر بود. با توجه به فراوانی ویروس پاپیلومای انسانی در ضایعات مورد بررسی می‏توان این گونه نتیجه گرفت که این ویروس‏ها می‏توانند در اتیولوژی و پاتوژنز این دسته از ضایعات نقش داشته باشند.

ﺗﺸﻜﺮ و ﻗﺪرداﻧﻲ

این مقاله برگرفته از پایان نامه به شماره 2866 از دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی مشهد می‏باشد. بدین وسیله از معاونت محترمپژوهشی آن دانشگاه جهت تصویب و پرداخت هزینه‏ های این مطالعه تقدیر و تشکر ‏می‏گردد.

  1. Seifi S, Shafaie S, Ghadiri S. Evaluation of Microvessel Density in Follicular Cyst, Keratocystic Odontogenic Tumor, and Ameloblastoma. Journal of Mashhad Dental School 2011; 35(1): 33-42
  2. Regezi JA, Sciubba JJ, Jordan RC. Oral pathology: Clinical pathologic correlations: Elsevier Health Sciences; 2016.
  3. Alam J, Siddiqui AA, Mian RI, Mirza AJ, Khan S, Alam MK. Histopathological Evaluation of Oral and Maxillofacial Lesions Managed at a Tertiary Care Teaching Hospital in Karachi, Pakistan. International Medical Journal 2018; 25(1): 42-4.
  4. Bernard H-U, Burk RD, Chen Z, van Doorslaer K, Zur Hausen H, de Villiers E-M. Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189 PV types and proposal of taxonomic amendments. Virology 2010; 401(1): 70-9.
  5. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Medical microbiology: Elsevier Health Sciences; 2015.
  6. Al-Kobaisi MF. Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology 24th Ed. Sultan Qaboos University Medical Journal [SQUMJ] 2007; 7(3): 273-5.
  7. Zheng Z-M, Baker CC. Papillomavirus genome structure, expression, and post-transcriptional regulation. Frontiers in bioscience: A Journal Virtual Library 2006; 11: 2286.
  8. Prevost A, Wilkinson M. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting ofpotato cultivars. Theoretical Applied Genetics 1999; 98(1): 107-12.
  9. Hormia M, Willberg J, Ruokonen H, Syrjänen S. Marginal periodontium as a potential reservoir of human papillomavirus in oral mucosa. Journal of Periodontology 2005; 76(3): 358-63.
  10. Cox M, Eveson J, Scully C. Human papillomavirus type 16 DMA in an odontogenic keratocyst. Journal Oral Pathology Medicine 1991; 20(3): 143-5.
  11. Rider CA, Rupkalvis R, Miller AS, Chen S-Y. Search for evidence of three viral agents in radicular (periapical) cysts with immunohistochemistry. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology Endodontics 1995; 80(1): 87-91.
  12. Tezal M, Scannapieco FA, Wactawski-Wende J, Hyland A, Marshall JR, Rigual NR, et al. Local inflammation and humanpapillomavirus status of head and neck cancers. Archives of Otolaryngology–Head & Neck Surgery. 2012; 138(7): 669-75.
  13. Xuan Y, Li G, Jiang H, Lin Z. Relationship between hedgehog signaling pathway molecules and HPV16 infection in uterine cervical cancers. Zhonghua bing li xue za zhi= Chinese Journal Pathology 2009; 38(3): 178-82.
  14. Kumamoto H, Ohki K, Ooya K. Expression of Sonic hedgehog (SHH) signaling molecules in ameloblastomas. Journal Oral Pathology Medicine 2004; 33(3): 185-90.
  15. Zhang L, Sun Z, Chen X, Chen Z. Immunohistochemical expression of SHH, PTC, SMO and GLI1 in glandular odontogenic cysts and dentigerous cysts. Oral Diseases 2010; 16(8): 818-22.
  16. Alsaegh MA, Zhu SR. Presence of Human papilloma virus in dentigerous cyst and Ameloblastoma. International Journal of enhanced Research in Science Technology& Engineering 2014; 3(2): 88-94.
  17. de Roda Husman A-M, Walboomers JM, van den Brule AJ, Meijer CJ, Snijders PJ. The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3′ endswith adjacent highly conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR. Journal General Virology 1995; 76(4): 1057-62.
  18. Kahn MA. Demonstration of human papillomavirus DNA in a peripheral ameloblastoma by in situ hybridization. Humanpathology 1992; 23(2): 188-91.
  19. Sand L, Jalouli J, Larsson P-A, Magnusson B, Hirsch J-M. Presence of human papilloma viruses in intraosseous ameloblastoma. Journal Oral Maxillofacial Surgery 2000; 58(10): 1129-34.
  20. Small IA, Waldron CA. Ameloblastomas of the jaws. Oral Surgery Oral Medicine Oral Pathology 1955; 8(3): 281-97.
  21. Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, Fukuda T, Nakajima T. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions. American Journal Pathology 1998; 153(6): 1741-8.