Document Type : original article
Authors
1 Assistant Professor, Department of Oral Medicine, School of Dentistry, Rafsanjan University of Medical Sciences, Rafsanjan, Iran
2 Assistant Professor, Epidemiology and Biostatistics, Occupational Environment Research Center, School of Medicine, Rafsanjan University of Medical Sciences, Rafsanjan, Iran
3 Assistant Professor, Department of Oral Medicine, School of Dentistry, North Khorasan University of Medical Sciences, Bojnourd, Iran
4 Dentist, Rafsanjan, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
مقدمه
کاندیدیازیس دهانی شایعترین عفونت فرصت‌طلب مخاط دهان است که به دنبال رشد بیش از حد قارچ کاندیدا در حفره دهان ایجاد می‌شود. شایعترین گونه کاندیدا در ایجاد کاندیدیازیس دهانی، کاندیدا آلبیکنس می باشد.(1) کاندیدا آلبیکنس قارچی است که در 20 تا 50 درصد از جمعیت سالم جزو فلور طبیعی دهان
می‌باشد و در تمام سطوح مخاطی دهان یافت
می‌شود. حضور عوامل مستعدکننده موضعی یا سیستمیک باعث می‌شود این قارج به صورت بیماریزا درآید.(2)
داروی موضعی که به عنوان درمان استاندارد استفاده می‌شود دهان‌شویه نیستاتین می‌باشد. طعم تلخ دهان‌شویه نیستاتین و مصرف مکرر به صورت چهار بار در روز و همچنین آماده‌سازی مکرر (تهیه دهان‌شویه به صورت سوسپانسیون) در طی دوره مصرف آن، منجربه عدم رضایت بیماران می شود.(3)
از داروهای ضدقارچ دیگری که برای درمان اشکال بالینی مختلف بیماری استفاده می‌شود می‌توان به داروهای گروه آزول Azoles)) به ویژه فلوکونازول اشاره کرد که دارای عوارض جانبی متعدد از جمله تهوع، درد شکمی، استفراغ، سردرد و راشهای پوستی می‌باشد(4) درمانهای ضدقارچی با استفاده از داروهای ضدقارچ معمول دارای اثرات جانبی متعددی بوده و مقاومتهای دارویی و عود مکرر عفونتهای کاندیدیایی را موجب
می‌شوند.(5) بنابراین استفاده از راهکارهای مناسب برای جایگزینی داروهای سنتتیک که مشکلات ذکر شده را از بین ببرد همواره مورد توجه بوده است. یکی از این راهکارها بهره گیری از داروهای گیاهی است.(6)
پونه کوهی با نام علمیOriganum vulgare گیاهی معطر از خانواده نعناعیان می‌باشد که در طب سنتی به عنوان مقوی، مدر، آرام بخش، ضدعفونی‌کننده و
التیام‌دهنده زخمها استفاده می‌شده است. این گیاه به علت دارا بودن ترکیبات فنولی تیمول و کارواکرول فعالیت ضدمیکروبی داشته و با توجه به نوع میکروب
و غلظت اسانس یا عصاره آن، اثرات باکتریوستاتیک
یا باکتریسیدال دارد. همچنین دارای ظرفیت بالای
آنتی اکسیدانی است. با توجه به وجود ترکیبات فنولی در پونه کوهی این گیاه فعالیت ضدقارچی بر روی کاندیدا آلبیکنس داشته ولی مطالعات در این زمینه و مقایسه اثر آن با داروهای ضدقارچ استاندارد موجود، کمتر انجام شده است(7). در این مطالعه اثر ضدقارچی گیاه پونه کوهی بر روی کاندیدا آلبیکنس با نیستاتین که یک داروی ضدقارچی رایج می‌باشد، مورد مقایسه قرار گرفت.
مواد و روشها
در این مطالعه آزمایشگاهی، ابتدا قسمتهای هوایی گیاه پونه کوهی که به صورت تصادفی از شهرستان بم روستای هرارون جمع‌آوری و توسط مرکز گیاه‌شناسی کرمان با شماره هرباریومی KF1418 مورد تأیید قرار گرفته بود، در محیطی گرم و خشک و کم رطوبت به دور از نور مستقیم و در سایه خشک گردید. در این مرحله از روش عصاره‌گیریHavasian و همکارانجهت تهیه عصاره آبی و الکلی پونه کوهی استفاده گردید.(8)
به منظور تهیه عصاره آبی گیاه، به 30 میلی‌لیتر آب مقطر، 3 گرم پودر گیاه اضافه شد و به مدت 24 ساعت بر روی شیکر (بهداد، تهران، ایران) قرار گرفت. محلول مورد نظر جهت حذف ذرات بزرگتر دکانته و ذرات کوچکتر با عبور از صافی غشاییpm 45/0 حذف شدند (روش نفوذی اصلاح شده). عصاره حاصل در مجاورت هوا خشک گردید و پودر خشک حاصل بعد از وزن کردن در آب مقطر حل شده و به عنوان عصاره آبی مورد استفاده قرار گرفت.
به منظور تهیه عصاره الکلی از روش خیساندن استفاده شد؛ در این روش 4 گرم پودر گیاه داخل ظرف شیشه ای تیره ریخته شد و به آن 500 میلی‌لیتر اتانول 80 درصد (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) افزوده شد. بعد از 24 ساعت، محتویات ظرف به مدت 20 دقیقه و با 600 دور در دقیقه سانتریفیوژ (Hettich, Berline, England ) شد و رسوبات جدا گردید. با کمک دستگاه حذف حلال در خلاء در دمای 50 درجه سانتیگراد اتانول حذف شد و عصاره تغلیظ شده برای خشک شدن به مدت 24 ساعت در دمای 50 درجه سانتیگراد قرار گرفت و بعد از خشک شدن کامل در فریزر منفی 20 درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری شد. سپس از هر یک از عصاره های آبی و الکلی موجود در غلظتهای 10، 20، 40، 80 و 100 درصد تهیه شد.(8)
در این مطالعه آزمایشگاهی از میکروارگانیسم کاندیدا آلبیکنس (با کد شناسایی 5027) استفاده شد که از مجموعه باکتریها و قارچهای صنعتی و عفونی ایران (PTCC) تهیه گردیده و در محیط SDA(sabouraud dextrose Agar) حاوی کلرامفنیکل (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) کشت داده شد. در شرایط استریل در هر یک از غلظتهای مورد استفاده پونه کوهی 10 دیسک قرار داده، ضمناً 10 دیسک هم داخل آب مقطر گذاشته و 10 دیسک به عنوان بلانک در نظر گرفته شد. بعد از یک ساعت دیسکهای اشباع شده در شرایط استریل به وسیله انبر برداشته شد و در انکوباتور 40 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه خشک شد.(9)
در این آزمایش از روش انتشار دیسک کاغذی استاندارد(9) استفاده شد. بدین‌صورت که ابتدا سوسپانسیونی از کاندیدا در سرم فیزیولوژی استریل تهیه شد به نحوی که کدورت حاصله معادل لوله/ مک فارلند شد و سپس با استفاده از یک سواپ استریل از سوسپانسیون مربوطه برداشته و در تماس سطح یک پلیت محتوی محیط سابورد گسترش داده و سپس داخل هر پلیت، دیسک حاوی عصاره پونه کوهی، یک دیسک نیستاتین 100 واحدی به عنوان کنترل مثبت (تصویر 1) و آب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده شد. دیسکها به فاصله 15 میلیمتر از لبه پلیت و 24 میلیمتر از مرکز دیسک بعدی گذاشته شد. تمام پلیتها در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت قرار داده شد. سپس قطر هاله عدم رشد برحسب میلیمتر و به وسیله کولیس
( Pakistan, Sialkot,Asim Instruments) با دقت 001/0 بر حسب دهم میلیمتر اندازه‌گیری شد (تصویر 2)
(در مواردی که قطر هاله عدم رشد بیضی شکل بوده، میانگین قطر کوچک و بزرگ محاسبه گردید)
تصویر 1. کنترل مثبت (نیستاتین)
تصویر 2. قطر هاله عدم رشد عصاره گیاه Origanum vulgare
داده ها پس از جمع‌آوری، توسط نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 21 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقادیر کمی به صورت حداقل، حداکثر و انحراف معیار ± میانگین گزارش شد. به منظور مقایسه میانگین قطر هاله عدم رشد عصاره الکلی پونه کوهی با غلظتهای 80 و 100 درصد با نیستاتین از آنالیز واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) و متعاقب آن از آزمون مقایسات چندگانه (Scheffe’s Multiple Comparisons test) استفاده شد. همچنین، به منظور مقایسه میانگین قطر هاله عدم رشد عصاره آبی و الکلی پونه کوهی در غلظت 100 درصد، از آزمون t دو نمونه مستقل (Independent two-sample t test) استفاده گردید.
نرمال بودن توزیع فراوانی داده های قطر هاله عدم رشد با آزمون ناپارامتری کلموگروف–اسمیرنوف (Kolmogorov-Smirnov) مورد ارزیابی قرار گرفت و با 05/0P> انحراف معنی‌داری نسبت به توزیع نرمال مشاهده نشد. همچنین، تساوی واریانس داده‌های قطر هاله عدم رشد با آزمون لِوِن برای همگنی واریانسها (Levene’s test of homogeneity of variances) مورد ارزیابی قرار گرفت و با 05/0P> تساوی واریانس گروهها مورد تأیید قرار گرفت. سطح معنی‌داری در آزمونها 05/0 در نظر گرفته شد.
یافته ها
نتایج به دست آمده از مقایسه میانگین قطر هاله عدم رشد میکروارگانیسم کاندیدا آلبیکنس در غلظتهای مختلف عصاره آبی و الکلی پونه کوهی و نیستاتین در جدول 1 نشان داده شده است.
آنالیز واریانس یک طرفه، تفاوت آماری معنی‌داری در میانگین قطر هاله عدم رشد عصاره الکلی پونه کوهی با غلظتهای 80 و 100 درصد و نیستاتین نشان داد (12/79=F، 001/0>P). سپس، آزمون مقایسات چندگانه (Scheffe’s Multiple Comparisons test) نشان داد که تأثیر نیستاتین بر روی قارچ کاندیدا آلبیکنس بیش از عصاره‌های الکلی 80 و 100 درصد پونه کوهی بود (001/0>P) و همچنین تأثیر عصاره الکلی 100% پونه کوهی بر روی قارچ کاندیدا آلبیکنس بیش از عصاره الکلی 80 درصد پونه کوهی بود (001/0>P).
همانگونه که در جدول 1 مشاهده می‌شود، آزمون آماری t دو نمونه مستقل(Independent two-sample t test)نشان داد که تأثیر نیستاتین بر روی قارچ کاندیدا آلبیکنس به طور معناداری بیش از عصاره آبی100% پونه کوهی بود (001/0>P). همچنین تأثیر عصاره الکلی100% پونه کوهی بر روی قارچ کاندیدا آلبیکنس به طور معناداری بیشتر از عصاره آبی 100% بود (001/0>P).
نتایج این بررسی آزمایشگاهی همچنین نشان داد که اثر ضدقارچی عصاره پونه کوهی در غلظتهای 10، 20، 40 و 80 درصد عصاره آبی پونه کوهی بر روی قارچ کاندیدا آلبیکنس تأثیری نداشت،
به طوری که قطر هاله عدم رشد غلظتهای فوق بر کاندیدا آلبیکنس صفر بود. همچنین، غلظتهای 10، 20 و 40 درصد عصاره الکلی پونه کوهی بر روی قارچ کاندیدا آلبیکنس تأثیری نداشت، به طوری که قطر هاله عدم رشد غلظتهای فوق بر قارچ کاندیدا آلبیکنس صفر بود.
جدول1.مقایسه میانگین قطر هاله عدم رشد (برحسب میلیمتر) غلظتهای مختلف عصاره آبی و الکلی گیاه پونه کوهی با نیستاتین
|
ماده مورد بررسی |
تعداد |
حداقل |
حداکثر |
انحراف معیار ± میانگین |
مقدار p |
|
عصاره آبی 100% نیستاتین |
10 10 |
5/6 2/20 |
9/6 5/21 |
34/0 ± 69/6 48/0 ± 6/21 |
001/0>* |
|
عصاره الکلی 80% عصاره الکلی 100% نیستاتین |
10 10 10 |
2/6 1/7 5/21 |
4/6 6/7 5/21 |
38/0 ± 32/6 34/0 ± 36/7 48/0 ± 6/21 |
001/0>** |
|
عصاره آبی 100% عصاره الکلی 100% |
10 10 |
5/6 1/7 |
9/6 6/7 |
34/0 ± 69/6 34/0 ± 36/7 |
001/0>* |
*آزمون t دو نمونه مستقل (Independent two-sample t test)، **آنالیز واریانس یک طرفه (One-way ANOVA)؛ اختلاف تمام زوج گروهها از نظر آماری معنی دار بود (001/0>P).
بحث
در این مطالعه آزمایشگاهی که به هدف بررسی
تاثیر عصاره آبی و الکلی گیاه پونه کوهی
(Origanum Vulgare) بر روی کاندیدا آلبیکنس و مقایسه آن با نیستاتین انجام شد، نتایج نشان داد تأثیر نیستاتین نسبت به غلظتهای به کار رفته عصاره آبی و الکلی گیاه پونه کوهی به صورت معنی‌داری بیشتر بود و قطر هاله عدم رشد در دیسکهای حاوی نیستاتین از تمامی غلظتهای گیاه پونه کوهی بیشتر بود.
در مطالعه Cleff و همکاران(10) فعالیت ضدقارچی اسانس Origanum vulgare علیه 60 نمونه کاندیدا مورد آزمایش قرار گرفت و تمام نمونه ها حساس بودند. طبق آنالیز کروماتوگرافی ترکیب اصلی اسانس شامل ترپینئول4، کارواکرول، تیمول و آلفا-ترپینئول بود.
در مطالعه Vale-silva و همکارانش(11) که خاصیت ضدمیکروبی اسانسOriganum vulgare را علیه پاتوژنهایی هم چون کاندیدا آلبیکنس مورد بررسی قرار دادند اسانس فعالیت قارچ کشی قوی را نشان داد. در مطالعه Pozzatti و همکاران(12) فعالیت ضدقارچی اسانس دارچین، آویشن، پونه کوهی و زنجبیل روی گونه‌های کاندیدای حساس به فلوکونازول و مقاوم به آن بررسی شد که در نهایت اسانس پونه کوهی بیشترین اثر ضدقارچی را داشت.
تنها مقاله مشابهی که روی عصاره الکی یکی دیگر از زیرگونه‌های Origanum انجام شده است، مقاله Leeja و Thoppil(13) است که عصاره الکلی 100 درصد Origanum majorana را علیه هفت قارچ و شش باکتری بررسی کرد. عصاره الکلی Origanum majorana دارای فعالیت قابل توجه علیه باکتری و قارچهای پاتوژن
مورد مطالعه بود و دارای اثربخشی بالا علیه رشد
Aspergillus niger بود. در مورد عصاره آبی مقاله مشابهی یافت نشد.
از ترکیبات گیاه Origanum vulgare کارواکرول، تیمول و فلانوییدها است. Gozeو همکاران(14) فعالیت ضدمیکروبی کارواکرول را در آزمایشگاه مورد ارزیابی قرار داد و نشان داد که کارواکرول ترکیب اصلی فعالیت ضدمیکروبی گیاه Origanum vulgare است.از آنجایی که هم اسانس و هم عصاره آبی و الکلی Origanum vulgare حاوی کارواکرول است، بنابراین نتایج ضعیفتر حاصل از عصاره آبی و الکلی در مطالعه ما نسبت به مطالعات انجام شده روی اسانس را می توان غلظت کمتر کارواکرول در عصاره آبی و الکلی نسبت به اسانس گیاه دانست.
در مطالعات انجام شده بر روی گیاه Origanum vulgare و گونه‌های مشابهOriganum هیچکدام به صورت مقایسه‌ای خاصیت ضدقارچی را با یک داروی ضدقارچ استاندارد بررسی نکرده‌اند و به همین دلیل ممکن است حتی تأثیر بر کاهش کلونی‌های کاندیدا را اثر ضدقارچی نامیده باشند. به دلیل معدود بودن مطالعات مشابه و نتایج متفاوت آنها مقایسه این مطالعه با سایر مطالعات کمی دشوار بوده و نمی‌توان به طور قطع هیچ عاملی را مسبب نتایج متفاوت دانست. تنها می‌توان استدلال کرد که احتمالاً عصاره آبی و الکلی این گیاه دارای ترکیبات ضدقارچی کمتری می‌باشد و پیشنهاد می‌شود از اسانس روغنی گیاه در مطالعات بعدی استفاده شود. با توجه به اختلاف زیاد قطر هاله عدم
رشد عصاره‌های آبی و الکلی گیاه پونه کوهی
(Origanum vulgare) در مقایسه با نیستاتین اثر ضدقارچی آن در سطح آزمایشگاهی قابل ملاحظه نبوده و به نظر می‌رسد نمی تواند به صورت بالینی مورد استفاده قرار گیرد.
نتیجه گیری
نتایج پژوهش حاضر نشان داد اثر ضدقارچی داروی نیستاتین بر روی کاندیدا آلبیکنس، بیشتر از عصاره آبی و الکلی گیاه Origanum vulgare بود؛ در حالیکه غلظتهای 10، 20، 40 و 80 درصد عصاره آبی و غلظتهای 10، 20 و 40 درصد عصاره الکلی هیچ تأثیری بر کاندیدا آلبیکنس نداشت.
تشکر و قدردانی
این مقاله منتج از پایان نامه شماره 504 از دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم‌پزشکی رفسنجان می‌باشد. بدین‌وسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه
علوم‌پزشکی رفسنجان به جهت حمایت مالی از این طرح تقدیر و تشکر به عمل می آید. همچنین از زحمات جناب آقای رضا بهرام آبادی نژاد کارشناس میکروبیولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم‌پزشکی رفسنجان سپاسگزاری می‌گردد.
)