بررسی هیستولوژیکی برهم‌کنش میان سلول‌های بنیادی مزانشیمی رت ویستار با ماتریکس لثه‌ انسان در شرایط آزمایشگاهی

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست سلولی تکوینی، گروه زیست شناسی، دانشکده‌ علوم، دانشگاه فردوسی مشهد

2 استاد گروه زیست شناسی، گروه تحقیقاتی سلول‌های بنیادی، پژوهشکده فناوری زیستی، دانشکده‌ علوم، دانشگاه فردوسی مشهد

3 دانشیار گروه زیست شناسی، گروه تحقیقاتی سلول‌های بنیادی، پژوهشکده فناوری زیستی، دانشکده‌ علوم، دانشگاه فردوسی مشهد

4 استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده‌ علوم، دانشگاه فردوسی مشهد

5 استادیار پریودانتیکس، مرکز تحقیقات دندانپزشکی، دانشکده‌ دندانپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد

چکیده

مقدمه: ماتریکس خارج سلولی بافت‌های طبیعی را می‌توان برداشت و به عنوان داربست زیستی برای بازسازی بافت‌ها و اندام‌ها بکار برد. در این مطالعه از ماتریکس سلول‌زدایی شده بافت لثه انسان، به عنوان داربستی جهت بررسی برهم‍کنش‍‌های هیستولوژیک میان سلول‌های بنیادی مزانشیمی گرفته شده از مغز استخوان رت ویستارو ماتریکس خارج سلولی بافت لثه‌ انسان، استفاده گردید.
مواد و روش‌ها: برای وصول به این هدف، ابتدا بافت‌های لثه انسان با استفاده از دو شوینده‌ سدیم دودسیل سولفات (SDS) و تریتون X-100 سلول‌زدایی شدند. پس از مراحل شستشو و استریلیزاسیون، داربست‌ها به سه گروه تقسیم شدند: گروه کم‌تراکم (LD) که با cells /cm2 104×8 سلول و گروه پرتراکم (HD) که با cells /cm2105×8 سلول کشت شدند و گروه کنترل (C) که بدون سلول در محیط کشت نگه داشته شد. از داربست‌های تهیه شدهقبل و پس از گذشت 1، 2 و 4 هفته از کشت با سلول‌های مزانشیمی، مقاطع میکروسکوپی تهیه و با استفاده از هماتوکسیلین-ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. معنی‏داری تغییرات تراکم سلولی داربست‏های سلولی به روش Repeated measure ANOVA و پس آزمون مقایسه میانگین‏ها به طور درون و برون گروهی بررسی شد و همچنین تعدادی از نمونه‌های لثه قبل و پس از فرآیند سلول‌زدایی مورد مطالعات میکروسکوپ الکترونی نگاره قرار گرفتند.
یافته‌ها: مطالعه‌ هیستولوژیک داربست‌ها پس از سلول‌زدایی نشان داد که هسته‌ها و اجزای سلولی به طور کامل از بافت حذف شده‌اند. بررسی با میکروسکوپ الکترونی نگاره مشخص کرد که طی فرآیند سلول‌زدایی، رشته‌های کلاژن در بافت همبند سالم مانده است. مطالعه‌داربست‌ها 1، 2 و 4 هفته پس از کشت نفوذ سلول‌های بنیادی مزانشیمی در داربست، مهاجرت سلول‌ها به سمت پاپیلاهای بافت همبند و تشکیل ساختارهای شبه اپیتلیوم را نشان داد. آنالیزهای آماری مشخص کرد که تراکم سلولی در داربست‌های گروه HD به طور معنی‏داری (05/0P<) بیشتر از گروه LD بود. تراکم سلولی در هر دو گروه LD و HD در هفته‌ دوم افزایش معنی‏دار و در هفته‌ چهارم کاهش معنی‏داری یافت.
نتیجه‌گیری: نتایج حاصل نشان می‌دهد که داربست حاصل از ماتریکس لثه انسان می‌تواند بستر مناسبی جهت بررسی رفتارهای سلولی طی ترمیم زخم‌های دهانی در شرایط آزمایشگاهی باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

In Vitro Histological Investigation of Interactions between Rat’s Mesenchymal Stem Cells and Human Gingival Matrix

نویسندگان [English]

  • Zahra Yarjanli 1
  • Nasser MahdaviShahri 2
  • Maryam MoghaddamMatin 3
  • Masoud Fereidoni 4
  • SeyedAli BanihashemRad 5
1 Student of Cellular and Developmental Biology, Dept of Biology, School of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
2 Professor, Dept of Biology, Stem cell Research Group, Institute of Biotechnology, School of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
3 Associate Professor, Dept of Biology, Stem cell Research Group, Institute of Biotechnology, School of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
4 Assistant Professor, Dept of Biology, School of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
5 Assistant Professor of Periodontics, Dental Research Center, School of Dentistry, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran
چکیده [English]

Introduction: Extracellular matrix of natural tissues can be used as a scaffold for reconstructing biological tissues and organs. In this study, decellularized human gingival matrix was used as a scaffold for investigating the interactions of rat’s bone marrow mesenchymal stem cells with human gingival matrix.
Materials & Methods: To reach this goal, human gingival tissues were decellularized by two detergents sodium dodecyl sulfate (SDS) and Triton X-100. After washing and sterilization procedures, scaffolds were divided into 3 groups. Low density (LD) group was cultivated with 8×104 cells /cm2, high density (HD) group was cultivated with 8×105 cells/cm2, and control (C) group, was maintained in culture medium without any cells. Microscopic sections were prepared from the scaffoldsbefore and after 1, 2 and 4 weeks of culture with mesenchymal cells and were stained with Hematoxylin-Eosin. Repeated measure ANOVA was used to study the cell density alteration significance within the matrixes and post tests of means comparisons were performed within and between the groups. Also, gingival samples before and after decellularization procedure were investigated by scanning electron microscopy.
Results: Histological study of decellularized scaffolds revealed that nuclear and cellular components of the tissues were completely removed. Scanning electron microscopy of the scaffolds indicated that collagen fibers of connective tissue remained intact. Study of the scaffolds 1, 2 and 4 weeks after culture, revealed penetration of mesenchymal stem cells in scaffold, migration of cells towards connective tissue’s papilla, and moreover epithelium-like structures. Statistical analysis indicated that cell density in HD group was significantly (P<0.05) higher than LD group. Cell density in both LD and HD groups significantly increased at 2nd week and decreased after4 weeks of culture.
Conclusion: According to the results, scaffolds prepared from human gingival matrix can be a suitable scaffold for studying In vitro cell behaviors during oral wound healing.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Extracellular matrix
  • epithelium
  • interaction
  • Scaffold
  • human gingiva
  • Mesenchymal stem cells

مقدمه

لثه بخشی از مخاط جونده است که زواید آلوئولی فک‌ها را می‌پوشاند و گردن دندان‌ها را احاطه می‌کند. در مقایسه با بافت نرم پوشاننده‌ لب‌ها و گونه‌ها، لثه اغلب اتصال محکمی به استخوان زیرین تشکیل می‌دهد که به مقاومت در برابر سایش با مواد غذایی کمک می‌کند. لثه از نظر آناتومیکی به سه ناحیه‌ مارژینال (آ‍زاد)، چسبنده (متصل) و بین‌دندانی تقسیم می‌گردد.(1)لثه‌ آزاد و چسبنده توسط خطی به موازات حاشیه‌ لثه از هم جدا می‌گردند. لثه از نظر میکروسکوپی از اپیتلیوم مکعبی مطبق، تیغه‌ میانی و آستر مخاط زیرین تشکیل شده است.(2) فیبرهای لثه که به نگهداری لثه در مجاورت دندان کمک می‌کند، اساساً از کلاژن نوع I و تاحدی کلاژن نوع III تشکیل شـده‏اند.(3) وجـود کلاژن، این بـافت را در مـقابل آماس

مقاوم‌تر از مخاط آلوئولی می‌کند.(4)

به دلیل تراکم بالای کلاژن در مخاط دهان، در چندین مطالعه از ترکیبات متفاوت کلاژن برای تهیه داربست جهت درمان زخم‌های حفره دهان استفاده شده است. Butler و همکارانش، ماتریکسهای متخلخل کلاژن-گلیکوز‌ آمینو‌گلیکان پوشیده با الاستومر سیلیکان را با سلول‌های اپیتلیال مخاط دهان انسان کشت دادند و به پشت موش پیوند زدند.(5)ماتریکس‌های کلاژنی ممکن است در مهندسی بافت کام و هر جای دیگر حفره‌ دهان مناسب باشند، اما محیط دهانی به طور کامل با محیط پوست تفاوت دارد. به علاوه، نشان داده شده که درمان زخم در پوست و حفره‌ دهان کاملاً متفاوت می‌باشد.(6) از معایب ماتریکس‌های کلاژنی طول عمر محدود، مقاومت اندک در برابر انقباض، همچنین اتصال ضعیف اپیدرم به آن را می‌توان ذکر نمود. همچنین بعضی از این ماتریکس‌های کلاژن منجر به بروز عوارض ایمنی می‌گردند.(7)

علاوه بر داربست‌های کلاژنی، از ماتریکس‌های طبیعی مانند آلودرم جهت پیوند در داخل دهان(8) استفاده شده است. آلودرم از پوست جسد انسان و از طریق فرآیند فریز-خشک ساخته شده است که عناصر ضروری ساختمان بافت شامل توزیع و معماری دستجات کلاژن را آسیب نمی‏زند.(9) Clark و همکارانش از آلودرم برای درمان شکاف کام استفاده نمودند و پیشنهاد کردند که آلودرم برای استفاده در بستن اولیه‌ شکاف‌های وسیعی که در کام سخت و نرم ایجاد می‌گردد، یک داربست سالم و مؤثر می‌باشد.(10) با این حال، استفاده از آلودرم به عنوان یک مدل تست در شرایط آزمایشگاهی مقرون به صرفه نمی‌باشد. به علاوه، بافت همبند گرفته شده از پوست به دلیل تفاوت در منشأ آن می‌تواند مورفولوژی اپیتلیوم و درنتیجه تکوین مدل مخاط دهان را تحت تأثیر قرار دهد.(11)

با ‌این حال، تاکنون داربستی از لثه انسان به منظور بررسی برهم‌کنش سلول‌ها با مخاط دهان طی ترمیم زخم تهیه نشده است. از این رو در این مطالعه تلاش شد بافت لثه با استفاده از روش‌های مختلف فیزیکی و شیمیایی سلول‌زدایی گردد و به عنوان داربستی جهت مطالعه‌ رفتار سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت ویستار بکار رود.

مواد و روش‌ها

نمونههای لثه انسان با کمک متخصص و جراح لثه در کلینیک تخصصی دندانپزشکی و با رعایت اصول اخلاقی مربوطه تهیه گردید. نمونه‌ها متعلق به مردان و زنان
45-20 ساله‌، فاقد بیماری‌های سیستمیک و غیرسیگاری بود که جهت درمان‌های ترمیمی-پروتز و جراحی‌ دندان عقل نهفته به کلینیک مراجعه کرده بودند. قطعات لثه‌ حاصل از جراحی‌ها‌ در سرم فیزیولوژی در دمای صفر درجه در یخچال نگهداری شدند. پس از جدا نمودن قطعات اضافی، اندازه‌ بافت‌ها به
mmmm5 رسید. به منظور سلول‌زدایی بافت‌ها، از محلول 1% SDS در فسفات بافر سالین (PBS) به مدت 24 ساعت و سپس محلول 1% تریتون X-100 در PBS به مدت 12 ساعت (همراه با همزدن دستی و در دمای اتاق) استفاده گردید. به منظور خروج شوینده‌ها از بافت، نمونه‌ها به مدت 2 ساعت در PBS قرار گرفتند، سپس در اتانل 75% غوطه‌ور شدند. این مرحله از کار 8 بار تکرار شد تا از خروج SDS از بافت، اطمینان حاصل گردد. به منظور استریلیزاسیون، داربست‌ها به مدت 30 دقیقه در اتانل70% قرار گرفتند (از این مرحله به بعد زیر هود لامینار انجام گرفت). برای حذف الکل، داربست‌ها با آب مقطر استریل شسته و به مدت 1 ساعت در  PBSاستریل قرار داده شدند.

برای آماده‌سازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، رت نر بالغ نژاد ویستار با استفاده از کلروفرم بیهوش و استخوان فمور آن در شرایط کاملاً استریل جدا گردید. ابتدا دو سر استخوان جدا و محتویات آن با تزریق محیط کشت DMEM[1] حاوی 10% سرم جنینی گاو (FBS) و µl10 پنیسیلین/ استرپتومایسین به داخل آن استخراج شد و سوسپانسیون حاصل به فلاسک انتقال یافت و در انکوباتور با دمای °c 37 و 5% CO2 نگهداری گردید. پس از 24 ساعت از کشت اولیه محیط کشت آن تعویض گردید و سلول‌های چسبنده به کف فلاسک باقی ماندند. محیط کشت سلول‌ها هر 4-3 روز یک‌بار تعویض گردید و سلول‌ها پس از پاساژ چهارم مورد استفاده قرار گرفتند.

برای کشت سلول‌ها بر روی داربست‌های لثه، ابتدا آن‌ها را تریپسینه نموده تا از فلاسک جدا گردند. پس از جدا شدن سلول‌ها از ظرف، محتویات آن در فالکون ml20 ریخته شد. پس از سانتریفیوژ و تعیین تعداد سلول‌ها با لام نئوبار، دو سوسپانسیون سلولی با میزان‌های 104×2 و 105×2 سلول در µl50 تهیه گردید.

داربست‌ها پس از 24 ساعت نگهداری در محیط کشت، در ظروف کشت 24 خانه‌ای قرار گرفتند. داربست‌ها به سه گروه 12 تایی کم‌تراکم، پرتراکم و کنترل تقسیم گردیدند. گروه کم تراکم با میزان cells /50µl 104×2 وگروه پرتراکم با cells /50µl 105×2 بر روی هر داربست کشت شدند و در گروه کنترل تنها محیط کشت به داربست‌ها اضافه گردید. پس از افزودن سوسپانسیون سلولی به داربست‌ها، به هر چاهک ml1 محیط کشت افزوده و هر 4-3 روز یک‌بار محیط کشت آن‌ها تعویض‌ گردید.

جهت مطالعه مورفولوژی و کنترل سلول‌زدایی، داربست‌ها قبل و 1، 2 و 4 هفته پس از کشت با استفاده از فیکساتور بوئن تثبیت و پس از مراحل پاساژ بافتی و آغشتگی به پارافین، قالب‌گیری شدند. از قالب‌ها مقاطعی با ضخامت 5 میکرون تهیه گردید و سپس با هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) و هماتوکسیلین وایگرت - پیک ایندیگو کارمین (H&P) رنگ‌آمیزی شدند.

مقاطع تهیه شده در رنگ‏آمیزی H&E پس از مراحل پارافین زدایی و آب‏دهی، به مدت 7-5 دقیقه با هماتوکسیلین (Art 4302) رنگ‏آمیزی شده و پس از شستشو با آب جاری و قرارگیری در الکل 70 به مدت
2-1 دقیقه با ائوزین
(C.I.Nr. 45380) رنگ‏آمیزی شدند. سپس مراحل آب‏دهی، شفاف سازی و مونتاژ انجام گرفت.

در ایـن پـژوهش جهت تـشخیص بـهتر هـسته‏هـا از

رشته‏های کلاژن از رنگ‏آمیزی H&P استفاده گردید. بدین صورت که مقاطع پس از پارافین زدایی و آب‏دهی، به مدت 7-5 دقیقه با هماتوکسیلین وایگرت رنگ‏آمیزی شدند. پس از شستشو با آب مقطر لام‏ها به مدت 10-4 ثانیه با پیک ایندیگوکارمین رنگ‏آمیزی شدند. مشابه قبل مراحل آب‏دهی، شفاف سازی و مونتاژ انجام گرفت. سپس لام‌ها با میکروسکوپ نوری (Olympus IX70 ساخت ژاپن) مشاهده و تصاویر با دوربین عکاسی Canon متصل به میکروسکوپ تهیه شدند.

به منظور تهیه مقاطع میکروسکوپ الکترونی نگارهLeo -VP1450) ساخت آلمان) نمونه‌ها پس از شستشو با سرم فیزیولوژی، به مدت 24 ساعت در فیکساتور گلوترآلدئید 5/2% با بافر کاکودیلات سدیم 1/0 مولار تثبیت شدند. پس از شستشو با بافر، با فیکساتور اسمیم تتراکساید 1% با بافر کاکودیلات سدیم 1/0 مولار به مدت 1 ساعت تثبیت گردیدند. پس از شستشو با بافر، نمونه‌ها با درجات صعودی اتانل (30%، 50%، 70%، 90% و 100%) آبگیری شدند. پس از خشک‌ شدن، نمونه‌ها روی گرید قرار گرفتند و با پوشش طلا-پالادیوم پوشانده شدند. نمونه‌ها با میکروسکوپ الکترونی نگاره (Leo-VP1450 ساخت آلمان) مشاهده و تصویربرداری شدند.

برای بررسی تراکم سلولی، 3 نمونه داربست از هر غلظت آماده گردید. سلول‌ها در مقاطع تهیه شده با رنگ‌آمیزی H&E و با بزرگنمایی 100X شمارش شده و در مساحت cm21 محاسبه گردید. محاسبات آماری برای بررسی اثربخشی تیمارها با بکارگیری برنامه رایانه‏ای Graph Pad Prism از آنالیز متغیر‏های Repeated measure استفاده شد. برای بررسی معنی‏داری تفاوت میانگین‏ها در هر گروه تیمار از پس آزمون آماری Tukey استفاده شد. نمودار با استفاده از نرم افزار Excel رسم گردید.

یافته‌ها

در این مطالعه به منظور تهیه داربست از لثه انسان (تصویر 1)، بافت‌های لثه ابتدا با استفاده از ترکیبی از روش‌های فیزیکی و شیمیایی سلول‌زدایی گردیدند. همانطور که در تصویر 2 مشاهده می‌گردد، مطالعه هیستولوژیک داربست‌ها با رنگآمیزی H&E نمایانگر حذف هسته‌ها و اجزای سلولی از بافت لثه پس از فرآیند سلول زدایی می‏باشد.

جهت بررسی تأثیر فرآیندهای آماده‌سازی بر ساختار رشته‌های کلاژن بافت از میکروسکوپ الکترونی نگاره استفاده گردید. در تصویر 3 مشاهده می‌شود که اپیتلیوم بافت همبند حفظ گردیده و رشته‌های کلاژن بافت سالم باقی مانده‌اند.

داربست‌های تهیه شده قبل و 1، 2 و 4 هفته پس از کشت با سلول‌های بنیادی مزانشیمی گرفته شده از مغز استخوان رت مورد بررسی قرار گرفتند. مطالعات بافت‌شناسی یک هفته پس از کشت سلول‌ها بر روی داربست لثه (تصویر 4) نمایانگر استقرار سلول‌ها در سطح داربست از جمله اپیتلیوم (تصویر 4-A)، نفوذ سلول‌ها به بافت همبند و مهاجرت سلول‌ها به مجاورت پاپیلاهای بافت همبند (تصویر 4-B) می‌باشد.

همانطور که در شکل 5 مشخص است، سلول‌هایی که در هفته‌ اول به صورت یک لایه روی اپیتلیوم قرار داشتند در هفته دوم تقسیم شده و ساختاری چند لایه شبیه اپیتلیوم (تصویر 5-A) را تشکیل دادند.

از نتایج جالب هفته چهارم تشکیل ساختارهایی شبیه حوضچه‌های خونی در بافت همبند را می‌توان ذکر نمود. لایه‌های سلولی بر روی اپیتلیوم به شکل منظم‌تر و گسترده‌تری قرار گرفته بودند. علاوه بر این، در هفته‌ چهارم در اطراف داربست بخش‌هایی از ماتریکس در حال تخریب و جدایی از آن (تصویر 5-B) مشاهده گردید که در میان آن‌ها آثار سلولی و گاهی خود سلول‌ها نیز وجود داشتند.

در این مطالعه داربست‌ها با دو میزان سلولی متفاوت cells/cm2105×8 و 104×8 کشت شدند. بررسی‌های آماری (جدول 1 و نمودار 1) نشان داد که تراکم سلولی در داربست‌های پرتراکم نسبت به داربست‌های کم‌تراکم به طور معنی‏داری بیشتر بود. علاوه بر این، تعداد سلول‌ها در هر دو نوع داربست، در هفته‌ دوم افزایش معنی‏دار و در هفته‌ چهارم کاهش معنی‏داری را نشان داد.

 

 

 

 

 

تصویر 1 : نمای کلی لثه انسان؛ ساختار کلی بافت لثه انسان شامل بافت همبند (A) و اپیتلیوم (B) را با درشت نمایی 10X و با رنگ‌آمیزی H&P نشان می‌دهد.

 

 


 

تصویر 2 : لثه انسان قبل و بعد از فرآیند سلولزدایی؛ لثه قبل  (A)و بعد (B) از فرآیند سلول‌زدایی با رنگ‌آمیزی H&E و درشت نمایی 40X حذف اجزای سلولی را نشان می‌دهد و پیکان نمایانگر سلول‌ها می‌باشد.

 

 

 

 

 

تصویر 3: بررسی لثه انسان پس از سلول‌زدایی با میکروسکوپ الکترونی نگاره؛ شکل A حفظ ساختار کلی لثه انسان پس از سلول‌زدایی، شکل B اپیتلیوم را به صورت یک توری خالی از سلول و شکل C و D رشته‌های کلاژن را در لثه سالم و لثه سلول‌زدایی شده نشان می‌دهد. پیکان‌ نشانگر پاپیلاهای بافت همبند می‌باشد.

 

تصویر 4 : مطالعه رفتار سلول‌های بنیادی مزانشیمی در هفته اول پس از کشت؛ استقرار سلول‌ها روی اپیتلیوم (A) و مهاجرت سلول‌ها به مجاورت پاپیلاهای بافت همبند (B) را با رنگ‌آمیزی H&P و درشت نمایی 40X نشان می‏دهد و پیکان نمایانگر سلول‌ها می‌باشد.

 

ب

ج

 

 


 

تصویر 5 : برهم‌کنش سلول‌های بنیادی مزانشیمی با داربست لثه در هفته دوم و چهارم پس از کشت؛ شکل A تشکیل اپیتلیوم جدید بر روی اپیتلیوم قبلی در هفته دوم را با درشت نمایی 100X و شکل B تخریب داربست در هفته چهارم با درشت نمایی 10X و رنگ‌آمیزی H&P نشان می‌دهد.

 

جدول 1 : مقایسه میانگین‏ها و انحراف معیارها بین گروه‏های کم تراکم و پرتراکم

SEM

Mean

گروه‌ها

24/15

22/158

کم‌تراکم هفته‌ اول

64/17

44/244

کم‌تراکم هفته‌ دوم

25/9

88/152

کم‌تراکم هفته‌ چهارم

50/30

55/255

پرتراکم هفته‌ اول

35/31

44/376

پرتراکم هفته‌ دوم

34/19

18/199

پرتراکم هفته‌ چهارم

 

+++

+

 

نمودار 1 : مقایسه میانگین تراکم سلولی در داربست‌های کم‌تراکم و پرتراکم؛

 

[behdasht_1] 


بحث

در این مطالعه تلاش شد تا با استفاده از دو شوینده SDS و تریتون X-100 بافت لثه انسان سلول‌زدایی گردد. SDS با انحلال غشا، دناتوره کردن پروتئین‌ها، حذف پروتئین‌های سیتوپلاسمی و هسته‌ای موجب سلول‌زدایی بافت و کاهش پاسخ ایمنوژنیک پس از پیوند داربست می‌گردد. با این حال تمایل SDS به آسیب به ساختار طبیعی بافت، برداشت گلیکوزامین‌گلیکان (GAG) و تخریب کلاژن از معایب استفاده از آن می‌باشد. تریتون برهم‌کنش‌های لیپید-لیپید و لیپید-پروتئین را تخریب می‌کند اما به برهمکنش‌های پروتئین-پروتئین آسیب نمی‌زند. کارآیی آن بسته به بافت بوده و موجب حذف GAG می‌گردد.(12)

آسیب به ساختار بافت و رشته‌های کلاژن آن می‌تواند با اثر بر استحکام مکانیکی بافت، رفتار سلول‌ها را تحت تأثیر قرار دهد. بررسی‏ها با کمک میکروسکوپ نوری و الکترونی نگاره (تصویر 3)، تخریبی در ساختار کلی بافت لثه و همچنین رشته‌های کلاژن بافت همبند نشان نداد و مشخص کرد که روش سلول‌زدایی موجب آسیب به بافت لثه و تغییر در ویژگی‏های مکانیکی آن نگردیده است.

داربست‌های لثه در هفته‌های اول، دوم و چهارم پس از کشت مورد مطالعات هیستولوژیک قرار گرفتند. همانطور که در تصویر 4-B مشخص است، سلول‌های بنیادی مزانشیمی در هفته اول پس از کشت، به فاصله میان اپیتلیوم و بافت همبندی لثه که غشای پایه قرار دارد، مهاجرت کردند و در مجاورت پاپیلاهای بافت همبند استقرار یافتند.

غشای پایه که زیر اپیتلیوم دهانی قرار دارد، سدی بین اپیتلیوم و بافت همبندی تشکیل می‌دهد. مولکول‌های لامینین و کلاژن نوع IV که توسط سلول‌های اپیتلیال تولید می‌شوند در تشکیل اپیتلیوم اهمیت دارند و سد اتصالی جداکننده‌ حفره‌ دهان از محیط میان بافتی را تثبیت می‌کنند. شکست این سد عامل مهمی در توسعه‌ بیماری پریودونتال می‌باشد و اصلاح آن برای درمان موفق پریودونتال یا بازسازی آن ضروری است.(7)

لامینین‌ها اجزای گلیکوپروتئینی مهم در غشای پایه می‌باشند و نقش مهمی در مهاجرت سلول‌های عصبی، تمایز و رشد آکسون‌ها ایفا می‌کنند.(13) گلیکوپروتئین‌های چسبنده از جمله فیبرونکتین و لامینین، اجزای ECM را به یکدیگر و به سلول‌ها متصل می‌کنند. گلیکوپروتئین‌ها به گیرنده‌های اختصاصی روی سلول و اجزای غشای پایه مانند کلا‍ژن نوع IV متصل می‌شوند و اتصال سلول اپیتلیالی را سرعت می‌بخشند.(14) با توجه به موارد مذکور به نظر می‌رسد که احتمالاً لامینین موجب تحریک مهاجرت و اتصال سلول‌ها در ناحیه غشای پایه شده است.

میان سلول‌هایی که به مجاورت پاپیلاها مهاجرت کرده بودند، تعدادی سلول‌ درحال تقسیم مشاهده شد. محققین نشان داده‌اند که لامینین به طور قابل توجهی دارای بعضی از توالی‌های مشابه فاکتور رشد می‌باشد که تنها زمان تجزیه در دسترس سلول قرار می‌گیرد.(15) احتمالاً سلول‌ها در حین مهاجرت، لامینین را تجزیه نموده و موجب رهایی این توالی‌های مشابه فاکتور رشد گردیده‌اند. توالی‌های مشابه فاکتور رشد آزاد شده از لامینین ممکن است تقسیم سلولی در این ناحیه را تحریک نموده باشند که تأیید این مطلب نیاز به بررسی‏های دقیق‏تری دارد.

همانطور که در مقاطع تهیه شده از داربست‌ها در هفته‌های مختلف کشت دیده شد، در نمونه‌های هفته اول سلول‌ها بر روی اپیتلیوم استقرار یافته و یک لایه بر روی آن تشکیل داده بودند (تصویر 4-A)، در هفته دوم سلول‌ها تکثیر یافته و ضخامت این لایه‌ را افزایش داده بودند (تصویر 5-A). این لایه‏های تازه تشکیل در هفته چهارم گسترده‌تر و منظم‌تر شده بودند. این ساختارهای مشابه اپیتلیوم تنها روی اپیتلیوم قبلی توانستند باقی بمانند و اتصالشان را به داربست حفظ کنند. احتمالاً اجزای کراتینی موجود در اپیتلیوم قبلی جایگاه مناسبی برای اتصال و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی فراهم نموده است. چنانچه در قبل ذکر گردید از معایب داربست‏های کلاژنی اتصال ضعیف اپیدرم به آن‏ها می‏باشد(7) که این مطالعه پیشنهاد می‏کند که با افزودن اجزای کراتینی بر سطح آن‏ها می‏توان این ضعف را برطرف نمود.

Wu و همکارانش نشان دادند که سلول‌های بنیادی مزانشیمی درمان زخم را در موش‌های دیابتی و غیردیابتی با تشکیل مجدد اپیدرم، نفوذ سلولی و رگزایی بهبود بخشیدند.(16) آن‌ها مشارکت مستقیم سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در بازسازی پوست و توانایی اپیتلیوم‌زایی آن‏ها را در شرایط In vivo نشان ‌دادند. مطالعه اخیر تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسان به کراتینوسیت را در شرایط In vitro نشان داد(17) اما توانایی تمایز BM-MSCs به کراتینوسیت در شرایط In vitro هنوز بررسی نشده است. این مطالعه پیشنهاد می‏کند که سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان توانایی تمایز به سمت کراتینوسیت‏ها را دارا می‏باشند.

برهم‌کنش‌های ماتریکس-سلول در شرایط In vivo، یک فرآیند دوجهتی و پویا می‌باشد. سلول‌ها در بافت‌ها پیوسته اطلاعات محیط اطرافشان را از سیگنال‌های ماتریکس خارج سلولی میپذیرند؛ سلول‌ها هم‌زمان ماتریکسشان را تولید می‌کنند و مکرراً آن را تغییر شکل می‌دهند.(13)

سلول‌ها زمانی که روی بافت همبندی لثه ساکن شدند، درحقیقت با ساختاری مشابه داربست‌های متراکم کلاژن روبرو گردیدند. زیرا بافت لثه شامل مقادیر زیادی کلاژن نوع I و میزان کمتری کلاژن نوع III می‌باشد.(1) تراکم بالای کلاژن می‌تواند مهاجرت سلول‌ها را ممانعت کند. مطالعه ‌Helary و همکارانش نشان داد زمانی‌ که فیبروبلاست‌ها با ماتریکس‌های متراکم کلاژن روبرو شدند، دیرتر از ماتریکس‌های سست به داخل آن نفوذ کردند.(18) در این مطالعه نیز تأخیر در مهاجرت سلول‏ها مشاهده گردید. بدین صورت که در هفته‌ اول و دوم، سلول‌ها بیشتر در سطح و حاشیه داربست استقرار داشتند اما در هفته چهارم بیشتر به داخل آن نفوذ کرده بودند. این مطالعه پیشنهاد می‏کند که تراکم بالای ماتریکس می‏تواند مهاجرت سلولی را به تأخیر اندازد.

در این مطالعه از دو میزان متفاوت 104×2 و105×2 سلول برای کشت بر روی داربست‏ها استفاده گردید. نتایج مشابهی در مورد دو گروه کم تراکم و پرتراکم به دست آمد. بدین صورت که در هفته دوم افزایش معنی‏دار و در هفته چهارم کاهش معنی‏دار در تراکم سلولی مشاهده گردید. افزایش تراکم سلولی در هفته دوم پیشنهاد می‏کند که داربست لثه بر سلول‏های مزانشیمی اثر میتوژنیک داشته است. مطالعات نیز نشان داده که تراکم بالای کلاژن موجب القای تقسیم سلولی در فیبروبلاست‏ها می‏گردد.(18) اما کاهش معنی‏دار در هفته چهارم ممکن است به دلیل تخریب داربست بر اثر نفوذ سلولی ایجاد شده باشد. همانطور که در تصاویر هفته چهارم (تصویر 5-B) مشخص است سلول‏ها برای نفوذ به داخل بافت شروع به تجزیه و تخریب آن نموده‏اند. احتمالاً میزان بالای تجزیه باعث جدا شدن بخش‌هایی از داربست گردیده که موجب جدایی سلول‌ها از سطح و کاهش معنی‏دار تراکم سلولی در داربست گردیده است (نمودار 1).

در برخی از مطالعات افزایش تعداد سلول‌های Seed شده بر روی داربست، تأثیری بر تراکم سلول‌ها در داخل داربست نداشته است و افزایش تعداد سلول‏ها باعث چسبیدن آن‏ها به یکدیگر و جدا شدنشان از سطح داربست گردیده است.(19) اما آنالیز آماری (نمودار 1) تفاوت معنی‏داری را بین گروه‌های کم‌تراکم و پرتراکم در هفته‌های اول و دوم پس از کشت نشان داد که در هفته چهارم این تفاوت معنی‏دار دیده نشد. این می‏تواند به علت تخریب بیشتر در داربست‏های پرتراکم ایجاد شده باشد. این مطالعه پیشنهاد می‏کند افزایش و یا کاهش تراکم سلولی به عوامل مختلفی از جمله نوع داربست و روش Seed کردن سلول‏ها بر روی داربست بستگی دارد و تنها با افزودن تعداد اولیه سلول‏ها نمی‏توان تراکم سلولی را در داربست به صورت طولانی مدت افزایش داد.

نتیجه‌گیری

مطالعات هیستولوژیک مهاجرت سلول‌ها به مجاورت پاپیلاهای بافت همبند، تقسیم سلولی و نفوذ به بافت همبند در هفته اول، تشکیل ساختارهای مشابه اپیتلیوم در هفته دوم، مهاجرت سلول‌ها به حوضچه‌های خونی و تخریب داربست در هفته چهارم را نشان داد.

با توجه به نتایج حاصل، داربست تهیه شده‌ از لثه‌ انسان می‌تواند بستر مناسبی جهت بررسی رفتارهای سلولی در طی درمان زخم‌های داخل دهانی باشد. امید است در آینده با تهیه داربست‌های قابل پیوند با منشأ لثه انسانی، مشکلات مربوط به جراحی‌های آزاد لثه حل گردد.

 

 

 

تشکر و قدردانی

این طرح به پشتیبانی مالی پژوهشکده فناوری زیستی دانشگاه فردوسی مشهد و از بودجه مصوبه مربوط به طرح کاربردی شماره 2944، همچنین معاونت محترم پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد و با همکاری خانم‌ مروارید ساعی نسب انجام شده است که بدین وسیله مراتب قدردانی از ایشان اعلام می‌گردد.



  1. Itoiz ME, Carranza FA. The gingiva. In: Newman MG, Takei HH, Carranza, FA.Carranza’s Clinical Periodontology. 9th ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2002. P. 30.
  2. Seo BM, Miura M, Gronthos S, Bartold PM, Batouli S, Brahim J, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet 2004; 364(9429): 149-55.
  3. Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science 1993; 260(5110): 920-6.
  4. Chapekar MS. Tissue engineering: Challenges and opportunities. J Biomed Mater Res 2000; 53(6): 617-20.
  5. Butler CE, Navarro FA, Park CS, Orgill DP. Regeneration of neomucosa using cell-seeded collagen-GAG matrices in athymic mice. Ann Plast Surg 2002; 48(3): 298-304.
  6. Jansen RG, van Kuppevelt TH, Daamen WF, Kuijpers-Jagtman AM, Von den Hoff JW. Tissue reactions to collagen scaffolds in the oral mucosa and skin of rats: Environmental and mechanical factors. Arch Oral Biol 2008; 53(4): 376-87.
  7. Stark HJ, Boehnke K, Mirancea N, Willhauck MJ, Pavesio A, Fusenig NE, et al. Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents. J Investig Dermatol Symp Proc 2006; 11(1): 93-105.
  8. Izumi K, Ferinberg SE, Iida A, Yoshizawa M. Intraoral grafting of an ex vivo produced oral mucosa equivalent: A preliminary report. Int J Oral Maxillofac Surg 2003; 32(2): 188-97.
  9. Kataoka T, Umeda M, Shigeta T, Takahashi H, Komori T. A new in vitro model of cancer invasion using AlloDerm, a human cadaveric dermal equivalent: A preliminary report. Kobe J Med Sci 2010; 55(5): 106-15.
  10. Clark JM, Saffold SH. Decellularized dermal grafting in cleft palate repair. Arch Facial Plast Surg 2003; 5(1): 40-4.
  11. Moharamzadeh K, Brook IM, Van Noort R, Scutt AM, Smith KG, Thornhill MH. Development, optimization and characterization of a full-thickness tissue engineered human oral mucosal model for biological assessment of dental biomaterials. J Mater Sci Mater Med 2008; 19(4): 1793-801.
  12. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials 2006; 27(19):
    3675-83.
  13. Salmerón-Sánchez M, Altankov G. Cell-protein-material interaction in tissue engineering. In: Eberli D. Tissue Engineering. 1st ed. New York: Springer-verlag New York Inc; 2009. P. 546.
  14. Couchman JR, Austria MR, Woods A. Fibronectin-cell interactions. J Invest Dermatol 1990; 94(6): 7-14.
  15. Francesco R, Antonio G, Manlio B, Alfonso B. From cell-ECM interactions to tissue engineering. J Cell Physiol 2004; 199(2): 174-80.
  16. Wu Y, Chen L, Scott PG, Tredget EE. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Stem Cells 2007; 25(10): 2648-59.
  17. Tran CT, Huynh DT, Gargiulo C, Nguyen PT, Tran TT, Huynh MT, et al. In vitro culture of keratinocytes from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: The Saigonese culture. Cell Tissue Bank 2011; 12(2): 125-33.
  18. Helary C, Ovtracht L, Coulomb B, Godeau G, Giraud-Guille MM. Dense fibrillar collagen matrices: A model to study myofibroblast behavior during wound healing. Biomaterials 2006; 27(25): 4443-52.
  19. Dar A, Shachar M, Leor J, Cohen S. Optimization of cardiac cell seeding and distribution in 3D porous alginate scaffolds. Biotechnol Bioeng 2002; 80(3): 305-12.