نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست سلولی تکوینی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد
2 استاد گروه زیست شناسی، گروه تحقیقاتی سلول‌های بنیادی، پژوهشکده فناوری زیستی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد
3 دانشیار گروه زیست شناسی، گروه تحقیقاتی سلول‌های بنیادی، پژوهشکده فناوری زیستی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد
4 استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد
5 استادیار پریودانتیکس، مرکز تحقیقات دندانپزشکی، دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Extracellular matrix of natural tissues can be used as a scaffold for reconstructing biological tissues and organs. In this study, decellularized human gingival matrix was used as a scaffold for investigating the interactions of rat’s bone marrow mesenchymal stem cells with human gingival matrix.
Materials & Methods: To reach this goal, human gingival tissues were decellularized by two detergents sodium dodecyl sulfate (SDS) and Triton X-100. After washing and sterilization procedures, scaffolds were divided into 3 groups. Low density (LD) group was cultivated with 8×104 cells /cm2, high density (HD) group was cultivated with 8×105 cells/cm2, and control (C) group, was maintained in culture medium without any cells. Microscopic sections were prepared from the scaffoldsbefore and after 1, 2 and 4 weeks of culture with mesenchymal cells and were stained with Hematoxylin-Eosin. Repeated measure ANOVA was used to study the cell density alteration significance within the matrixes and post tests of means comparisons were performed within and between the groups. Also, gingival samples before and after decellularization procedure were investigated by scanning electron microscopy.
Results: Histological study of decellularized scaffolds revealed that nuclear and cellular components of the tissues were completely removed. Scanning electron microscopy of the scaffolds indicated that collagen fibers of connective tissue remained intact. Study of the scaffolds 1, 2 and 4 weeks after culture, revealed penetration of mesenchymal stem cells in scaffold, migration of cells towards connective tissue’s papilla, and moreover epithelium-like structures. Statistical analysis indicated that cell density in HD group was significantly (P<0.05) higher than LD group. Cell density in both LD and HD groups significantly increased at 2nd week and decreased after4 weeks of culture.
Conclusion: According to the results, scaffolds prepared from human gingival matrix can be a suitable scaffold for studying In vitro cell behaviors during oral wound healing.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
لثه بخشی از مخاط جونده است که زواید آلوئولی فک‌ها را می‌پوشاند و گردن دندان‌ها را احاطه می‌کند. در مقایسه با بافت نرم پوشاننده لب‌ها و گونه‌ها، لثه اغلب اتصال محکمی به استخوان زیرین تشکیل می‌دهد که به مقاومت در برابر سایش با مواد غذایی کمک می‌کند. لثه از نظر آناتومیکی به سه ناحیه مارژینال (آزاد)، چسبنده (متصل) و بین‌دندانی تقسیم می‌گردد.(1)لثه آزاد و چسبنده توسط خطی به موازات حاشیه لثه از هم جدا می‌گردند. لثه از نظر میکروسکوپی از اپیتلیوم مکعبی مطبق، تیغه میانی و آستر مخاط زیرین تشکیل شده است.(2) فیبرهای لثه که به نگهداری لثه در مجاورت دندان کمک می‌کند، اساساً از کلاژن نوع I و تاحدی کلاژن نوع III تشکیل شـدهاند.(3) وجـود کلاژن، این بـافت را در مـقابل آماس
مقاوم‌تر از مخاط آلوئولی می‌کند.(4)
به دلیل تراکم بالای کلاژن در مخاط دهان، در چندین مطالعه از ترکیبات متفاوت کلاژن برای تهیه داربست جهت درمان زخم‌های حفره دهان استفاده شده است. Butler و همکارانش، ماتریکس‌های متخلخل کلاژن-گلیکوز آمینو‌گلیکان پوشیده با الاستومر سیلیکان را با سلول‌های اپیتلیال مخاط دهان انسان کشت دادند و به پشت موش پیوند زدند.(5)ماتریکس‌های کلاژنی ممکن است در مهندسی بافت کام و هر جای دیگر حفره دهان مناسب باشند، اما محیط دهانی به طور کامل با محیط پوست تفاوت دارد. به علاوه، نشان داده شده که درمان زخم در پوست و حفره دهان کاملاً متفاوت می‌باشد.(6) از معایب ماتریکس‌های کلاژنی طول عمر محدود، مقاومت اندک در برابر انقباض، همچنین اتصال ضعیف اپیدرم به آن را می‌توان ذکر نمود. همچنین بعضی از این ماتریکس‌های کلاژن منجر به بروز عوارض ایمنی می‌گردند.(7)
علاوه بر داربست‌های کلاژنی، از ماتریکس‌های طبیعی مانند آلودرم جهت پیوند در داخل دهان(8) استفاده شده است. آلودرم از پوست جسد انسان و از طریق فرآیند فریز-خشک ساخته شده است که عناصر ضروری ساختمان بافت شامل توزیع و معماری دستجات کلاژن را آسیب نمی‌زند.(9) Clark و همکارانش از آلودرم برای درمان شکاف کام استفاده نمودند و پیشنهاد کردند که آلودرم برای استفاده در بستن اولیه شکاف‌های وسیعی که در کام سخت و نرم ایجاد می‌گردد، یک داربست سالم و مؤثر می‌باشد.(10) با این حال، استفاده از آلودرم به عنوان یک مدل تست در شرایط آزمایشگاهی مقرون به صرفه نمی‌باشد. به علاوه، بافت همبند گرفته شده از پوست به دلیل تفاوت در منشأ آن می‌تواند مورفولوژی اپیتلیوم و درنتیجه تکوین مدل مخاط دهان را تحت تأثیر قرار دهد.(11)
با این حال، تاکنون داربستی از لثه انسان به منظور بررسی برهم‌کنش سلول‌ها با مخاط دهان طی ترمیم زخم تهیه نشده است. از این رو در این مطالعه تلاش شد بافت لثه با استفاده از روش‌های مختلف فیزیکی و شیمیایی سلول‌زدایی گردد و به عنوان داربستی جهت مطالعه رفتار سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان رت ویستار بکار رود.
مواد و روش‌ها
نمونه‌های لثه انسان با کمک متخصص و جراح لثه در کلینیک تخصصی دندانپزشکی و با رعایت اصول اخلاقی مربوطه تهیه گردید. نمونه‌ها متعلق به مردان و زنان
45-20 ساله، فاقد بیماری‌های سیستمیک و غیرسیگاری بود که جهت درمان‌های ترمیمی-پروتز و جراحی دندان عقل نهفته به کلینیک مراجعه کرده بودند. قطعات لثه حاصل از جراحی‌ها در سرم فیزیولوژی در دمای صفر درجه در یخچال نگهداری شدند. پس از جدا نمودن قطعات اضافی، اندازه بافت‌ها به mm5×mm5 رسید. به منظور سلول‌زدایی بافت‌ها، از محلول 1% SDS در فسفات بافر سالین (PBS) به مدت 24 ساعت و سپس محلول 1% تریتون X-100 در PBS به مدت 12 ساعت (همراه با همزدن دستی و در دمای اتاق) استفاده گردید. به منظور خروج شوینده‌ها از بافت، نمونه‌ها به مدت 2 ساعت در PBS قرار گرفتند، سپس در اتانل 75% غوطه‌ور شدند. این مرحله از کار 8 بار تکرار شد تا از خروج SDS از بافت، اطمینان حاصل گردد. به منظور استریلیزاسیون، داربست‌ها به مدت 30 دقیقه در اتانل70% قرار گرفتند (از این مرحله به بعد زیر هود لامینار انجام گرفت). برای حذف الکل، داربست‌ها با آب مقطر استریل شسته و به مدت 1 ساعت در PBSاستریل قرار داده شدند.
برای آماده‌سازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، رت نر بالغ نژاد ویستار با استفاده از کلروفرم بیهوش و استخوان فمور آن در شرایط کاملاً استریل جدا گردید. ابتدا دو سر استخوان جدا و محتویات آن با تزریق محیط کشت DMEM[1] حاوی 10% سرم جنینی گاو (FBS) و µl10 پنی‌سیلین/ استرپتومایسین به داخل آن استخراج شد و سوسپانسیون حاصل به فلاسک انتقال یافت و در انکوباتور با دمای °c 37 و 5% CO2 نگهداری گردید. پس از 24 ساعت از کشت اولیه محیط کشت آن تعویض گردید و سلول‌های چسبنده به کف فلاسک باقی ماندند. محیط کشت سلول‌ها هر 4-3 روز یک‌بار تعویض گردید و سلول‌ها پس از پاساژ چهارم مورد استفاده قرار گرفتند.
برای کشت سلول‌ها بر روی داربست‌های لثه، ابتدا آن‌ها را تریپسینه نموده تا از فلاسک جدا گردند. پس از جدا شدن سلول‌ها از ظرف، محتویات آن در فالکون ml20 ریخته شد. پس از سانتریفیوژ و تعیین تعداد سلول‌ها با لام نئوبار، دو سوسپانسیون سلولی با میزان‌های 104×2 و 105×2 سلول در µl50 تهیه گردید.
داربست‌ها پس از 24 ساعت نگهداری در محیط کشت، در ظروف کشت 24 خانه‌ای قرار گرفتند. داربست‌ها به سه گروه 12 تایی کم‌تراکم، پرتراکم و کنترل تقسیم گردیدند. گروه کم تراکم با میزان cells /50µl 104×2 وگروه پرتراکم با cells /50µl 105×2 بر روی هر داربست کشت شدند و در گروه کنترل تنها محیط کشت به داربست‌ها اضافه گردید. پس از افزودن سوسپانسیون سلولی به داربست‌ها، به هر چاهک ml1 محیط کشت افزوده و هر 4-3 روز یک‌بار محیط کشت آن‌ها تعویض گردید.
جهت مطالعه مورفولوژی و کنترل سلول‌زدایی، داربست‌ها قبل و 1، 2 و 4 هفته پس از کشت با استفاده از فیکساتور بوئن تثبیت و پس از مراحل پاساژ بافتی و آغشتگی به پارافین، قالب‌گیری شدند. از قالب‌ها مقاطعی با ضخامت 5 میکرون تهیه گردید و سپس با هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) و هماتوکسیلین وایگرت - پیک ایندیگو کارمین (H&P) رنگ‌آمیزی شدند.
مقاطع تهیه شده در رنگ‌آمیزی H&E پس از مراحل پارافین زدایی و آبدهی، به مدت 7-5 دقیقه با هماتوکسیلین (Art 4302) رنگ‌آمیزی شده و پس از شستشو با آب جاری و قرارگیری در الکل 70 به مدت
2-1 دقیقه با ائوزین (C.I.Nr. 45380) رنگ‌آمیزی شدند. سپس مراحل آبدهی، شفاف سازی و مونتاژ انجام گرفت.
در ایـن پـژوهش جهت تـشخیص بـهتر هـستههـا از
رشته‌های کلاژن از رنگ‌آمیزی H&P استفاده گردید. بدین صورت که مقاطع پس از پارافین زدایی و آبدهی، به مدت 7-5 دقیقه با هماتوکسیلین وایگرت رنگ‌آمیزی شدند. پس از شستشو با آب مقطر لام‌ها به مدت 10-4 ثانیه با پیک ایندیگوکارمین رنگ‌آمیزی شدند. مشابه قبل مراحل آبدهی، شفاف سازی و مونتاژ انجام گرفت. سپس لام‌ها با میکروسکوپ نوری (Olympus IX70 ساخت ژاپن) مشاهده و تصاویر با دوربین عکاسی Canon متصل به میکروسکوپ تهیه شدند.
به منظور تهیه مقاطع میکروسکوپ الکترونی نگارهLeo -VP1450) ساخت آلمان) نمونه‌ها پس از شستشو با سرم فیزیولوژی، به مدت 24 ساعت در فیکساتور گلوترآلدئید 5/2% با بافر کاکودیلات سدیم 1/0 مولار تثبیت شدند. پس از شستشو با بافر، با فیکساتور اسمیم تتراکساید 1% با بافر کاکودیلات سدیم 1/0 مولار به مدت 1 ساعت تثبیت گردیدند. پس از شستشو با بافر، نمونه‌ها با درجات صعودی اتانل (30%، 50%، 70%، 90% و 100%) آبگیری شدند. پس از خشک شدن، نمونه‌ها روی گرید قرار گرفتند و با پوشش طلا-پالادیوم پوشانده شدند. نمونه‌ها با میکروسکوپ الکترونی نگاره (Leo-VP1450 ساخت آلمان) مشاهده و تصویربرداری شدند.
برای بررسی تراکم سلولی، 3 نمونه داربست از هر غلظت آماده گردید. سلول‌ها در مقاطع تهیه شده با رنگ‌آمیزی H&E و با بزرگنمایی 100X شمارش شده و در مساحت cm21 محاسبه گردید. محاسبات آماری برای بررسی اثربخشی تیمارها با بکارگیری برنامه رایانهای Graph Pad Prism از آنالیز متغیرهای Repeated measure استفاده شد. برای بررسی معنیداری تفاوت میانگینها در هر گروه تیمار از پس آزمون آماری Tukey استفاده شد. نمودار با استفاده از نرم افزار Excel رسم گردید.
یافته‌ها
در این مطالعه به منظور تهیه داربست از لثه انسان (تصویر 1)، بافت‌های لثه ابتدا با استفاده از ترکیبی از روش‌های فیزیکی و شیمیایی سلول‌زدایی گردیدند. همانطور که در تصویر 2 مشاهده می‌گردد، مطالعه هیستولوژیک داربست‌ها با رنگ‌آمیزی H&E نمایانگر حذف هسته‌ها و اجزای سلولی از بافت لثه پس از فرآیند سلول زدایی می‌باشد.
جهت بررسی تأثیر فرآیندهای آماده‌سازی بر ساختار رشته‌های کلاژن بافت از میکروسکوپ الکترونی نگاره استفاده گردید. در تصویر 3 مشاهده می‌شود که اپیتلیوم بافت همبند حفظ گردیده و رشته‌های کلاژن بافت سالم باقی مانده‌اند.
داربست‌های تهیه شده قبل و 1، 2 و 4 هفته پس از کشت با سلول‌های بنیادی مزانشیمی گرفته شده از مغز استخوان رت مورد بررسی قرار گرفتند. مطالعات بافت‌شناسی یک هفته پس از کشت سلول‌ها بر روی داربست لثه (تصویر 4) نمایانگر استقرار سلول‌ها در سطح داربست از جمله اپیتلیوم (تصویر 4-A)، نفوذ سلول‌ها به بافت همبند و مهاجرت سلول‌ها به مجاورت پاپیلاهای بافت همبند (تصویر 4-B) می‌باشد.
همانطور که در شکل 5 مشخص است، سلول‌هایی که در هفته اول به صورت یک لایه روی اپیتلیوم قرار داشتند در هفته دوم تقسیم شده و ساختاری چند لایه شبیه اپیتلیوم (تصویر 5-A) را تشکیل دادند.
از نتایج جالب هفته چهارم تشکیل ساختارهایی شبیه حوضچه‌های خونی در بافت همبند را می‌توان ذکر نمود. لایه‌های سلولی بر روی اپیتلیوم به شکل منظم‌تر و گسترده‌تری قرار گرفته بودند. علاوه بر این، در هفته چهارم در اطراف داربست بخش‌هایی از ماتریکس در حال تخریب و جدایی از آن (تصویر 5-B) مشاهده گردید که در میان آن‌ها آثار سلولی و گاهی خود سلول‌ها نیز وجود داشتند.
در این مطالعه داربست‌ها با دو میزان سلولی متفاوت cells/cm2105×8 و 104×8 کشت شدند. بررسی‌های آماری (جدول 1 و نمودار 1) نشان داد که تراکم سلولی در داربست‌های پرتراکم نسبت به داربست‌های کم‌تراکم به طور معنیداری بیشتر بود. علاوه بر این، تعداد سلول‌ها در هر دو نوع داربست، در هفته دوم افزایش معنیدار و در هفته چهارم کاهش معنیداری را نشان داد.
تصویر 1 : نمای کلی لثه انسان؛ ساختار کلی بافت لثه انسان شامل بافت همبند (A) و اپیتلیوم (B) را با درشت نمایی 10X و با رنگ‌آمیزی H&P نشان می‌دهد.
تصویر 2 : لثه انسان قبل و بعد از فرآیند سلول‌زدایی؛ لثه قبل (A)و بعد (B) از فرآیند سلول‌زدایی با رنگ‌آمیزی H&E و درشت نمایی 40X حذف اجزای سلولی را نشان می‌دهد و پیکان نمایانگر سلول‌ها می‌باشد.
تصویر 3: بررسی لثه انسان پس از سلول‌زدایی با میکروسکوپ الکترونی نگاره؛ شکل A حفظ ساختار کلی لثه انسان پس از سلول‌زدایی، شکل B اپیتلیوم را به صورت یک توری خالی از سلول و شکل C و D رشته‌های کلاژن را در لثه سالم و لثه سلول‌زدایی شده نشان می‌دهد. پیکان نشانگر پاپیلاهای بافت همبند می‌باشد.
تصویر 4 : مطالعه رفتار سلول‌های بنیادی مزانشیمی در هفته اول پس از کشت؛ استقرار سلول‌ها روی اپیتلیوم (A) و مهاجرت سلول‌ها به مجاورت پاپیلاهای بافت همبند (B) را با رنگ‌آمیزی H&P و درشت نمایی 40X نشان می‌دهد و پیکان نمایانگر سلول‌ها می‌باشد.
|
ب |
|
ج |
تصویر 5 : برهم‌کنش سلول‌های بنیادی مزانشیمی با داربست لثه در هفته دوم و چهارم پس از کشت؛ شکل A تشکیل اپیتلیوم جدید بر روی اپیتلیوم قبلی در هفته دوم را با درشت نمایی 100X و شکل B تخریب داربست در هفته چهارم با درشت نمایی 10X و رنگ‌آمیزی H&P نشان می‌دهد.
جدول 1 : مقایسه میانگینها و انحراف معیارها بین گروه‌های کم تراکم و پرتراکم
|
SEM |
Mean |
گروه‌ها |
|
24/15 |
22/158 |
کم‌تراکم هفته اول |
|
64/17 |
44/244 |
کم‌تراکم هفته دوم |
|
25/9 |
88/152 |
کم‌تراکم هفته چهارم |
|
50/30 |
55/255 |
پرتراکم هفته اول |
|
35/31 |
44/376 |
پرتراکم هفته دوم |
|
34/19 |
18/199 |
پرتراکم هفته چهارم |
|
+++ |
|
+ |
نمودار 1 : مقایسه میانگین تراکم سلولی در داربست‌های کم‌تراکم و پرتراکم؛
بحث
در این مطالعه تلاش شد تا با استفاده از دو شوینده SDS و تریتون X-100 بافت لثه انسان سلول‌زدایی گردد. SDS با انحلال غشا، دناتوره کردن پروتئین‌ها، حذف پروتئین‌های سیتوپلاسمی و هسته‌ای موجب سلول‌زدایی بافت و کاهش پاسخ ایمنوژنیک پس از پیوند داربست می‌گردد. با این حال تمایل SDS به آسیب به ساختار طبیعی بافت، برداشت گلیکوزامین‌گلیکان (GAG) و تخریب کلاژن از معایب استفاده از آن می‌باشد. تریتون برهمکنشهای لیپید-لیپید و لیپید-پروتئین را تخریب می‌کند اما به برهمکنشهای پروتئین-پروتئین آسیب نمی‌زند. کارآیی آن بسته به بافت بوده و موجب حذف GAG می‌گردد.(12)
آسیب به ساختار بافت و رشته‌های کلاژن آن می‌تواند با اثر بر استحکام مکانیکی بافت، رفتار سلول‌ها را تحت تأثیر قرار دهد. بررسیها با کمک میکروسکوپ نوری و الکترونی نگاره (تصویر 3)، تخریبی در ساختار کلی بافت لثه و همچنین رشته‌های کلاژن بافت همبند نشان نداد و مشخص کرد که روش سلول‌زدایی موجب آسیب به بافت لثه و تغییر در ویژگیهای مکانیکی آن نگردیده است.
داربست‌های لثه در هفته‌های اول، دوم و چهارم پس از کشت مورد مطالعات هیستولوژیک قرار گرفتند. همانطور که در تصویر 4-B مشخص است، سلول‌های بنیادی مزانشیمی در هفته اول پس از کشت، به فاصله میان اپیتلیوم و بافت همبندی لثه که غشای پایه قرار دارد، مهاجرت کردند و در مجاورت پاپیلاهای بافت همبند استقرار یافتند.
غشای پایه که زیر اپیتلیوم دهانی قرار دارد، سدی بین اپیتلیوم و بافت همبندی تشکیل می‌دهد. مولکول‌های لامینین و کلاژن نوع IV که توسط سلول‌های اپیتلیال تولید می‌شوند در تشکیل اپیتلیوم اهمیت دارند و سد اتصالی جداکننده حفره دهان از محیط میان بافتی را تثبیت می‌کنند. شکست این سد عامل مهمی در توسعه بیماری پریودونتال می‌باشد و اصلاح آن برای درمان موفق پریودونتال یا بازسازی آن ضروری است.(7)
لامینین‌ها اجزای گلیکوپروتئینی مهم در غشای پایه می‌باشند و نقش مهمی در مهاجرت سلول‌های عصبی، تمایز و رشد آکسون‌ها ایفا می‌کنند.(13) گلیکوپروتئین‌های چسبنده از جمله فیبرونکتین و لامینین، اجزای ECM را به یکدیگر و به سلول‌ها متصل می‌کنند. گلیکوپروتئین‌ها به گیرنده‌های اختصاصی روی سلول و اجزای غشای پایه مانند کلاژن نوع IV متصل می‌شوند و اتصال سلول اپیتلیالی را سرعت می‌بخشند.(14) با توجه به موارد مذکور به نظر می‌رسد که احتمالاً لامینین موجب تحریک مهاجرت و اتصال سلول‌ها در ناحیه غشای پایه شده است.
میان سلول‌هایی که به مجاورت پاپیلاها مهاجرت کرده بودند، تعدادی سلول درحال تقسیم مشاهده شد. محققین نشان داده‌اند که لامینین به طور قابل توجهی دارای بعضی از توالی‌های مشابه فاکتور رشد می‌باشد که تنها زمان تجزیه در دسترس سلول قرار می‌گیرد.(15) احتمالاً سلول‌ها در حین مهاجرت، لامینین را تجزیه نموده و موجب رهایی این توالی‌های مشابه فاکتور رشد گردیده‌اند. توالی‌های مشابه فاکتور رشد آزاد شده از لامینین ممکن است تقسیم سلولی در این ناحیه را تحریک نموده باشند که تأیید این مطلب نیاز به بررسی‌های دقیقتری دارد.
همانطور که در مقاطع تهیه شده از داربست‌ها در هفته‌های مختلف کشت دیده شد، در نمونه‌های هفته اول سلول‌ها بر روی اپیتلیوم استقرار یافته و یک لایه بر روی آن تشکیل داده بودند (تصویر 4-A)، در هفته دوم سلول‌ها تکثیر یافته و ضخامت این لایه را افزایش داده بودند (تصویر 5-A). این لایه‌های تازه تشکیل در هفته چهارم گسترده‌تر و منظم‌تر شده بودند. این ساختارهای مشابه اپیتلیوم تنها روی اپیتلیوم قبلی توانستند باقی بمانند و اتصالشان را به داربست حفظ کنند. احتمالاً اجزای کراتینی موجود در اپیتلیوم قبلی جایگاه مناسبی برای اتصال و تکثیر سلول‌های بنیادی مزانشیمی فراهم نموده است. چنانچه در قبل ذکر گردید از معایب داربست‌های کلاژنی اتصال ضعیف اپیدرم به آن‌ها می‌باشد(7) که این مطالعه پیشنهاد می‌کند که با افزودن اجزای کراتینی بر سطح آن‌ها می‌توان این ضعف را برطرف نمود.
Wu و همکارانش نشان دادند که سلول‌های بنیادی مزانشیمی درمان زخم را در موش‌های دیابتی و غیردیابتی با تشکیل مجدد اپیدرم، نفوذ سلولی و رگزایی بهبود بخشیدند.(16) آن‌ها مشارکت مستقیم سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در بازسازی پوست و توانایی اپیتلیوم‌زایی آن‌ها را در شرایط In vivo نشان دادند. مطالعه اخیر تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسان به کراتینوسیت را در شرایط In vitro نشان داد(17) اما توانایی تمایز BM-MSCs به کراتینوسیت در شرایط In vitro هنوز بررسی نشده است. این مطالعه پیشنهاد می‌کند که سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان توانایی تمایز به سمت کراتینوسیتها را دارا می‌باشند.
برهمکنشهای ماتریکس-سلول در شرایط In vivo، یک فرآیند دوجهتی و پویا می‌باشد. سلول‌ها در بافت‌ها پیوسته اطلاعات محیط اطرافشان را از سیگنال‌های ماتریکس خارج سلولی می‌پذیرند؛ سلول‌ها هم‌زمان ماتریکسشان را تولید می‌کنند و مکرراً آن را تغییر شکل می‌دهند.(13)
سلول‌ها زمانی که روی بافت همبندی لثه ساکن شدند، درحقیقت با ساختاری مشابه داربست‌های متراکم کلاژن روبرو گردیدند. زیرا بافت لثه شامل مقادیر زیادی کلاژن نوع I و میزان کمتری کلاژن نوع III می‌باشد.(1) تراکم بالای کلاژن می‌تواند مهاجرت سلول‌ها را ممانعت کند. مطالعه Helary و همکارانش نشان داد زمانی که فیبروبلاست‌ها با ماتریکس‌های متراکم کلاژن روبرو شدند، دیرتر از ماتریکس‌های سست به داخل آن نفوذ کردند.(18) در این مطالعه نیز تأخیر در مهاجرت سلول‌ها مشاهده گردید. بدین صورت که در هفته اول و دوم، سلول‌ها بیشتر در سطح و حاشیه داربست استقرار داشتند اما در هفته چهارم بیشتر به داخل آن نفوذ کرده بودند. این مطالعه پیشنهاد می‌کند که تراکم بالای ماتریکس می‌تواند مهاجرت سلولی را به تأخیر اندازد.
در این مطالعه از دو میزان متفاوت 104×2 و105×2 سلول برای کشت بر روی داربست‌ها استفاده گردید. نتایج مشابهی در مورد دو گروه کم تراکم و پرتراکم به دست آمد. بدین صورت که در هفته دوم افزایش معنیدار و در هفته چهارم کاهش معنیدار در تراکم سلولی مشاهده گردید. افزایش تراکم سلولی در هفته دوم پیشنهاد می‌کند که داربست لثه بر سلول‌های مزانشیمی اثر میتوژنیک داشته است. مطالعات نیز نشان داده که تراکم بالای کلاژن موجب القای تقسیم سلولی در فیبروبلاست‌ها می‌گردد.(18) اما کاهش معنیدار در هفته چهارم ممکن است به دلیل تخریب داربست بر اثر نفوذ سلولی ایجاد شده باشد. همانطور که در تصاویر هفته چهارم (تصویر 5-B) مشخص است سلول‌ها برای نفوذ به داخل بافت شروع به تجزیه و تخریب آن نمودهاند. احتمالاً میزان بالای تجزیه باعث جدا شدن بخش‌هایی از داربست گردیده که موجب جدایی سلول‌ها از سطح و کاهش معنیدار تراکم سلولی در داربست گردیده است (نمودار 1).
در برخی از مطالعات افزایش تعداد سلول‌های Seed شده بر روی داربست، تأثیری بر تراکم سلول‌ها در داخل داربست نداشته است و افزایش تعداد سلول‌ها باعث چسبیدن آن‌ها به یکدیگر و جدا شدنشان از سطح داربست گردیده است.(19) اما آنالیز آماری (نمودار 1) تفاوت معنیداری را بین گروه‌های کم‌تراکم و پرتراکم در هفته‌های اول و دوم پس از کشت نشان داد که در هفته چهارم این تفاوت معنیدار دیده نشد. این می‌تواند به علت تخریب بیشتر در داربست‌های پرتراکم ایجاد شده باشد. این مطالعه پیشنهاد می‌کند افزایش و یا کاهش تراکم سلولی به عوامل مختلفی از جمله نوع داربست و روش Seed کردن سلول‌ها بر روی داربست بستگی دارد و تنها با افزودن تعداد اولیه سلول‌ها نمیتوان تراکم سلولی را در داربست به صورت طولانی مدت افزایش داد.
نتیجه‌گیری
مطالعات هیستولوژیک مهاجرت سلول‌ها به مجاورت پاپیلاهای بافت همبند، تقسیم سلولی و نفوذ به بافت همبند در هفته اول، تشکیل ساختارهای مشابه اپیتلیوم در هفته دوم، مهاجرت سلول‌ها به حوضچه‌های خونی و تخریب داربست در هفته چهارم را نشان داد.
با توجه به نتایج حاصل، داربست تهیه شده از لثه انسان می‌تواند بستر مناسبی جهت بررسی رفتارهای سلولی در طی درمان زخم‌های داخل دهانی باشد. امید است در آینده با تهیه داربست‌های قابل پیوند با منشأ لثه انسانی، مشکلات مربوط به جراحی‌های آزاد لثه حل گردد.
تشکر و قدردانی
این طرح به پشتیبانی مالی پژوهشکده فناوری زیستی دانشگاه فردوسی مشهد و از بودجه مصوبه مربوط به طرح کاربردی شماره 2944، همچنین معاونت محترم پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد و با همکاری خانم مروارید ساعی نسب انجام شده است که بدین وسیله مراتب قدردانی از ایشان اعلام می‌گردد.
)