بررسی حضور ژنوم ویروس HHV7 در ضایعات لیکن پلان دهانی به روش PCR

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشیار بیماری‏های دهان، فک و صورت، مرکز تحقیقات پرفسور ترابی نژاد، دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

2 دندانپزشک

3 دستیار تخصصی بیماری‏های دهان، فک و صورت، مرکز تحقیقات پرفسور ترابی نژاد، دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه:لیکن پلان دهانی (OLP)یک بیماری التهابی شایع با علت نامعلوم است که نقش ویروس ها در بروز آن مطرح است. ویروس HHV7، منحصر به فرد با شیوع جهانی ٩٠ درصدبوده و جزو خانواده هرپس ویریده و زیرخانواده بتاهرپس ویرینه به شمار می رود. بر طبق مطالعات قبلی این ویروس به شکل معنی داری در ضایعات لیکن پلان پوستی یافت شده است. هدف از این مطالعه بررسی فراوانی ژنوم HHV7 در ضایعات لیکن پلان دهانی با روش PCRبود.
مواد و روش ها: ٣٠ نمونه بلوک پارافینی از ضایعات لیکن پلان دهانی و ٣٠ نمونه از مخاط نرمال همان افراد از بیماران مراجعه کننده به بخش بیماری های دهان اصفهان گرفته شد. نمونه ها با روش PCR از لحاظ حضور ژنوم HHV7 مورد ارزیابی قرار گرفتند و داده ها بر اساس آزمون مک نیمار با سطح معنی داری  05/0P= آنالیز شدند.
یافته ها: از ٣٠ نمونه بررسی شده دارای ضایعه لیکن پلان دهانی، 10 مورد از لحاظ وجود ژنوم HHV7 مثبت گزارش شدند. نمونه های گروه شاهد از لحاظ وجود ویروس، منفی گزارش شدند.
نتیجه گیری: در این مطالعه ارتباط معنی داری بین عفونت به ویروس HHV7 و  OLPیافت شد. (002/0P=)

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of the Presencs of HHV7 DNA in Oral Lichenplanus Lesions by Polymerase Chain Reaction Method

نویسندگان [English]

  • Parichehr Ghalayani 1
  • Negar Sarrafan 2
  • Laleh Amini 3
  • Milad Alikhani 3
1 Associate Professor of Oral Medicine, Torabinejad Research Center, School of Dentistry, Isfahan University of Medical of Sciences, Isfahan, Iran
2 Dentist
3 Postgraduate Student of Oral Medicine, Torabinejad Research Center, School of Dentistry, Isfahan University of Medical of Sciences, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction: Oral lichen planus (OLP) is a common inflammatory disease with an unknown etiology; nevertheless, involvement of viral agents has been suggested in the literature. Human herpesvirus-7 (HHV-7) is a distinctive virus with a 90% global prevalence. It is a member of the Herpesviridae family and Betaherpesvirinae subfamily. Previous studies have confirmed the role of HHV-7 in cutaneous lichen planus lesions. Accordingly, the aim of this study was to evaluate the frequency of HHV-7 DNA genome in OLP lesions, using real-time polymerase chain reaction (PCR) method.
Materials & Methods: A total of 30 paraffin blocks from OLP lesions, as well as 30 samples from the normal mucosa, were collected from patients, referring to dental care clinics of Isfahan, Iran. The samples were evaluated for HHV-7 DNA genome, using the conventional PCR method. Data were analyzed via McNemar’s test, and the significance level was set at P=0.05.
Results: A total of 10 out of 30 samples from OLP lesions showed positive HHV-7 DNA genome, while none of the control samples showed viral presence.
Conclusions: There was a significant relationship between HHV-7 infection and OLP occurrence (P=0.002).

کلیدواژه‌ها [English]

  • Oral Lichen Planus
  • HHV-7
  • PCR

مقدمه

لیکن پلان دهانی یک بیماری مزمن التهابی است که مخاط دهان را درگیر می کند. شیوع این بیماری ۵/0 تا ۲/۲ درصد گزارش شده است. عواملی مثل استرس، دیابت، تروما، ویروس ها، حساسیت به برخی داروها و فلزات از فاکتورهای اتیولوژیک این بیماری هستند.(١) در نمای هیستوپاتولوژیک ارتشاح نواری شکل لنفوسیت های Tبه همراه ماکروفاژها و دژنراسیون لایه بازال دیده می شود.(۲) اکثر سلول های موضع CD8+T هستند که جایگزین کراتینوسیت های آپاپتوتیک می شوند. از طرفی سلول های CD8+ باعث آپوپتوز سلول های آلوده به ویروس نیز می شوند. بنابراین می توان گفت که عفونت های ویروسی مخاط دهان به ویژه هرپس ویروس ها ممکن است در بیماری زایی لیکن پلان دهانی نقش داشته باشد.(4و3)

فعالیت سیتوتوکسیک سلول های CD8 توسط Anti-MHC-class I تا حدودی کنترل می شود. همراهی یک آنتی ژن مشخص با MHC-class I ممکن است در ایجاد آپاپتوز و ایجاد لیکن پلان دهانی دخیل باشد. این آنتی ژن ممکن است ویروس باشد. DNAویروس های متعددی در مخاط دهان یافت شده است؛ از جمله هرپس ویروس ها و پاپیلوما ویروس ها.(۵) (Human Herpes Virus7) HHV7ویروسی با شیوع 90 درصد در بزرگسالان است. عفونی شدن به این ویروس به طور عمده در کودکی صورت می گیرد. همانند (Epestein barr virus) EBV که بروز مجددش در ایجاد لنفوم بورکیت نقش دارد فعالیت مجدد HHV7 نیز می تواند در ایجاد لیکن پلان موثر باشد.(۶) از آن جا که ویژگی بارز HHV7 لنفوتروپیک بودن آن است، سلول های دندریتیک پلاسماسیتوییدی نیز می توانند میزبان این ویروس باشند.(۷) سلول هایی که در هیستوپاتولوژی لیکن پلان کم دیده نمی شوند. همزمانی ویروس هپاتیت C و لیکن پلان دهانی توسط Lodiو همکاران(۸) گزارش شد. De vriesو همکارانش(٩) همراهی HHV7 DNAرا با سلول های پلاسماسیتویید دندریتیکی در لیکن پلان پوستی گزارش کردند. در مطالعه دیگری که توسط Oflatharaو همکارانش(١٠) انجام گرفت HHV7در درصد کمی از نمونه های لیکن پلان دهانی یافت شد و نتایج معنی دار نبود. با توجه به ضد و نقیض بودن این یافته ها و انجام نشدن بررسی حضور این ویروس در ضایعات دهانی، در این مطالعه تصمیم گرفتیم تیتر HHV7 DNAرا در این ضایعات بررسی کنیم.

مواد و روش ها

در این مطالعه مورد-شاهدی، ٣٠ نفر از بیماران مراجعه کننده به بخش بیماری های دهان، فک و صورت دانشکده دندانپزشکی اصفهان که مبتلا به لیکن پلان دهانی بودند انتخاب شدند. عدم وجود بیماری های سیستمیک مثل هپاتیت C و دیابت، فقدان سایر شرایط لیکنوییدی مثل واکنش های ناشی از دارو، بیماری پیوند علیه میزبان و لیکنویید تماسی از معیار های ورود به مطالعه بودند. همگی این بیماران برای تایید تشخیص بیماری نیازمند بیوپسی همراه با حاشیه سالم بودند. محل ضایعه به عنوان نمونه تست و حاشیه سالم کلینیکی به عنوان نمونه کنترل استفاده گردید. مطالعه بر اساس بیانیه هلسینگی(١١) و با رضایت کامل بیماران صورت گرفت. برای حفظ DNA، نمونه ها در محلول Fine fixنگه داری شدند. نمونه ها پس از پروسس شدن شماره گذاری شدند و از هر بلوک پارافینی پس از ضدعفونی کردن میکروتوم با گزیلول و الکل، چند مقطع گرفته شد. مقطع اول با ضخامت ۴ میکرون جهت رنگ آمیزی و ۴ مقطع بعدی با ضخامت ١٠ میکرون هماتوکسیلین ائوزین (H&E)جهت PCR تهیه شد. دو پاتولوژیست کیفیت نمونه ها برای H&E را تایید کردند. جهت استخراج DNA سه مرحله کار انجام شد.

در آزمایشگاه بلوک ها ابتدا با ١ میلی لیتر اتانول ١٠٠ درصد جهت زدودن پارافین و گزیلول خوب تکان داده شدند. سپس در مرحله دوم سانتریفوژ شدند تا برای لیز سلولی آماده شوند. پس از 15 دقیقه سانتریفوژ، مایع رویی خارج شد؛ مجدد اتانول افزوده شد و این عمل تکرار گردید. الکل نیز با باز گذاشتن در نمونه ها کاملاً زدوده شد. سپس با استفاده از پروتئیناز K در غلظت mg/ml١٠ و قرار دادن آن ها در دمای ۵۶ درجه سانتی گراد به مدت ٣ ساعت، عمل لیز سلولی برای استخراج DNAصورت گرفت.

سپس برای غیرفعال کردن پروتئیناز، نمونه ها ١٠ دقیقه در آب جوش گذاشته شدند. در مرحله سوم هم DNA مورد استخراج قرار گرفت. از روش Chelex-100برای استخراج 100 نانوگرم DNAاستفاده شد. به هر تیوب ١٠٠ میکرون از محلول ۵ Chelex-100 % افزوده شد. و به مدت ١٠ دقیقه در ٩٩ درجه حرارت داده شدند. سپس ١٠۵٠٠ دور برای ١۵ دقیقه سانتریفوژ شدند و فوراً به یخ منتقل شدند. در آخر نیز در ۴۵ درجه همراه با ١٠٠ میکرون کلروفرم حرارت داده شده و برای مراحل بعد ذخیره شدند.

اندازه گیری کمیت DNA استخراج شده توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج 260 نانومتر (Nano Drop-ND 1000)با نسبت OD260/280انجام شد کیفیت نیز با روش β action amplification مورد بررسی قرار گرفت.(12)

برای انجام Primer set, Conventional PCR
استاندارد
HHV-7 tegument protein pp85،
(Advanced Biotechnologies Inc, Columbia, MD, U.S.A) با توالی زیر استفاده شد.

Sense HHV7-1(5՜-TTTACATGCAGATGACATTCTCA-3՜)

Antisense HHV7-2(5՜-TGGATTGACACGCGGTGATTT-3՜

 

ترکیب انجام PCR شامل 5/1 میلی مول MgCl2، 100 میکرومول (dNTP) Deoxynucleotide Triphosphate، 200 پیکومول پرایمر و 2.5 واحد Taq polymerase بود.

50 میکرولیتر از ترکیب حاوی 100 نانوگرم از DNA نمونه 5 دقیقه در 94 درجه سانتی گراد انکوبه شد. سپس 40 سیکل (°C٩۵ برای 60 ثانیه جهت جدا شدن دو رشته DNA، °C۴٠ برای 2 دقیقه جهت باند شدن پرایمر با DNA نمونه و °C۷۲ برای 90 ثانیه جهت انجام پلیمریزاسیون توسط DNA پلیمراز) سپس هم در °C۸٠ برای 10 ثانیه نگه داشته شدند تا Dimer noise احتمالی برطرف شود انجام شد. پس از واکنش PCR الکتروفورز صورت گرفت و نتایج با دستگاه UV eliminating Transilluminator مشاهده شد. برای کنترل نتایج از کنترل مثبت و منفی استفاده کردیم. نمونه هایی که در محیط 2 درصد آگارز در برابر مارکر مورد نظر تشکیل باند داده بودند مثبت تلقی شدند. (تصویر 1)

 

 

تصویر 1 : اسکن الکتروفورز

 

برای آنالیز نتایج از آزمون مک نیمار و نرم افزار SPSSبا ویرایش 21 استفاده کردیم. میزان 05/0P<معنی دار در نظر گرفه شد.

یافته ها

در این مطالعه، از ٣٠ نفر شرکت کننده در مطالعه ۲۲ مورد (۷٣ درصد) زن و ۸ مورد (۲۷ درصد) مرد بودند. بیماران دارای میانگین سنی ۴١ سال بودند (3/0±41). در این بیماران به طور میانگین ۶ ماه (4/0±185 روز) از دوره بیماری می گذشت. نمونه های برداشته شده همگی از ناحیه گونه بودند و جهت کاهش موارد مخدوش گر از سایر نواحی مثل لثه نمونه برداری نشد. از ٣٠ نمونه تست مورد بررسی ١٠ نمونه (٣٣ درصد) دارای HHV7 DNAبودند و نمونه های کنترل همگی منفی بودند. (جدول 1)

میزان P valueبه دست آمده از آزمون مک نیمار 002/0 به دست آمد که از نظر آماری معنی دار بود.

بحث

در سال های اخیر نقش سیستم ایمنی در لیکن پلان دهانی موثر دانسته  شده است. حضور ماکروفاژها خود بیانگر نقش سیستم ایمنی سلولی در پاتوژنز این ضایعات است. در این بیماری سلول های tسیتوتوکسیک علیه لایه بازال وارد عمل می شوند و ارتشاح نواری شکل پیدا می کنند. در حقیقت لیکن پلان دهانی (OLP) یک بیماری چندعاملی می باشد و عواملی هم چون استرس، ژنتیک، جنس و ... نیز در آن ایجاد آن دخیل می باشند.(١) امروزه اثر ویروس ها در این بیماری پوستی-مخاطی در مطالعات متعددی مورد بررسی قرار گرفته است. یک دسته از این ویروس ها خانواده هرپس ویریده می باشند. HHV7 اولین بار توسط Frenkle و همکارانش(13) روی سلول های TCD4 افراد سالم کشف شد. این ویروس در سرم 90 درصد افراد، به خصوص افراد دارای ضعف سیستم ایمنی و در همراهی با ویروس HHV6کشف شده است.(14)


 

 

جدول 1 : تعداد نمونه های مثبت و منفی از نظر آلودگی به ویروس HHV7

 

مثبت

(درصد) تعداد

منفی

(درصد) تعداد

کل

(درصد) تعداد

آزمون مک نیمار

ضایعه لیکن پلان

(3/33)10

(7/66)20

(0/100)30

002/0P=

مخاط نرمال

(0/0)0

(0/100)30

(0/100)30

 


در مطالعه ما ٣٣ درصد ضایعات لیکن پلان دهانی از نظر این ویروس مثبت بودند. که میزان قابل توجهی است؛ اما هیچ یک از نمونه های کنترل مثبت نشدند. به هر حال بررسی های آماری ارتباط معنی داری بین حضور این ویروس و ایجاد لیکن پلان دهانی نشان نداد. مطالعات مشابه معدودی روی لیکن پلان پوستی صورت گرفته است که نتایج ضد و نقیضی داشته اند.

de vries و همکارانش(15) در مطالعه ای به این نتیجه رسیدند که بهبود ضایعات لیکن پلان با کاهش بیان پروتئین های HHV7 در سلول های پلاسماسیتویید دندریتیک در ارتباط است. با این حال Moravvej و همکارانش(16) در مورد لیکن پلان پوستی به این نتیجه رسیدند که HHV7در اتیولوژی بی تاثیر است. Levy(17) نیز در مطالعه ای نقش احتمالی برای اتیولوژی HHV7 در ضایعات پوستی سندرم بهجت قایل شده است. برخلاف او  Michiko و همکارانش(18) وجود چنین نقشی را رد کرده اند.

با توجه به این که درصد زیادی از بیماران دارای لیکن پلان دهانی بدون درگیری پوستی هستند و با مدنظر داشتن خواستگاه و ساختار متفاوت پوست و غشای مخاطی، تحقیقات روی حضور ویروس ها در ضایعات مخاطی لیکن پلان لازم به نظر می رسد.(20و19)

Oflatharta و همکارانش(10) مطالعه ای بر روی ضایعات مخاطی انجام دادند؛ اما به علت درصد کم حضور این ویروس در ضایعات دهانی بیشتر ویروس پاپیلوما را مشکوک به داشتن نقش اتیولوژیک دانستند.

در هر صورت در مورد حضور HHV7در ضایعات لیکن پلان دهانی مطالعات بسیار اندکی صورت گرفته است. در مطالعه حاضر DNA این ویروس در حجم 33 درصد از نمونه های تست در ضایعات دهانی مشاهده شد. اما باید در نظر داشت که ویروس HHV7 می تواند طی پروسه ای التهابی تکثیر شود وحضور این ویروس در ضایعات نمی تواند به طور قاطع نمایانگر رابطه علت و معلولی باشد. مطالعات بیشتری با روش های متفاوت از نظر دستگاه های سنجش حضور ویروس و حجم نمونه برای ارتباط این ویروس و لیکن پلان دهانی پیشنهاد می شود. هم چنین مطالعاتی در مورد وخامت ضایعات دهانی و حضور این ویروس و سایر هرپس ویروس ها توصیه می گردد.

نتیجه گیری

در این مطالعه ارتباط معنی داری بین عفونت به ویروس HHV7 و لیکن پلان دهانی یافت شد و در 33 درصد نمونه ها DNAویروس حضور داشت که قابل توجه بود.

تشکر و قدردانی

این مقاله برگرفته از پایان نامه به شماره 389243 مصوب دانشگاه علوم پزشکی اصفهان می باشد. نویسندگان این مقاله مایلند صمیمانه از مرکز تحقیقات ترابی نژاد، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان و بخش بیماری های دهان، فک و صورت تشکر کنند.

  1. Burket LW, Greenberg MS, Glick M. Burket's Oral Medicine: Diagnosis & Treatment. 11th ed. Hamilton: B.C. Decker Inc, 2008. P. 89-95.
  2. Lodi G, Scully C, Carrozzo M, Griffiths M, Sugerman PB, Thongprasom K. Current controversies in oral lichen planus: Report of an international consensus meeting. Part 2. Viral infections and etiopathogenesis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2005; 100(2): 78-164.
  3. Matthews JB, Scully CM, Potts AJ. Oral lichen planus: An immunoperoxidase study using monoclonal antibodies to lymphocyte subsets. Br J Dermatol 1984; 111(5): 587-95.
  4. Khan A, Farah CS, Savage NW, Walsh LJ, Harbrow DJ, Sugerman PB. Th1 cytokines in oral lichen planus. J Oral Pathol Med 2003; 32(2): 77-83.
  5. Lodi G, Scully C, Carrozzo M, Griffiths M, Sugerman PB, Thongprasom K. Current controversies in oral lichen planus: Report of an international consensus meeting. Part 1. Viral infections and etiopathogenesis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2005; 100(1): 40-51.
  6. Black JB, Pellett PE. Human herpesvirus 7. Rev Med Virol 1999; 9(4): 245-62.
  7. Secchiero P, Berneman ZN, Gallo RC, Lusso P. Biological and molecular characteristics of human herpesvirus 7: in vitro growth optimization and development of a syncytia inhibition test. Virology 1994; 202(1): 506-12.
  8. Lodi G, Pellicano R, Carrozzo M. Hepatitis C virus infection and lichen planus: A systematic review with meta-analysis. Oral Dis 2010; 16(7): 601-12.
  9. De Vries HJ, van Marle J, Teunissen MB, Picavet D, Zorgdrager F, Bos JD, et al. Lichen planus is associated with human herpesvirus type 7 replication and infiltration of plasmacytoid dendritic cells. Br J Dermatol 2006; 154(2): 361-5.
  10. Oflatharta C, Flint SR, Toner M, Butler D, Mabruk MJ. Investigation into a possible association between oral lichen planus, the human herpesviruses, and the human papillomaviruses. Mol Diagn 2003; 7(2): 73-83.
  11. World Medical Association. World Medical Association Declarationof Helsinki. Ethical principles for medical research involving humansubjects. Nurs Ethics 2002; 9(1): 105-9.
  12. Soto Y, Valdes C, Mune M, Pimentel T, Ramirez R. Detection of type 16 human papillomavirus DNA informalin-fixed invasive squamous cells from laryngeal cancers by polymerase chain reaction. MemInst Oswaldo Cruz 1998; 93(4): 439-40.
  13. Jodi B, Pellet P. Human herpesvirus. Rev Med Vitrol 1999; 9(4): 245-62.
  14. Feldstein AE, Razonable RR, Boyce TG. Prevalence and clinical significance of human herpesviruses 6 and 7 active infection in pediatric liver transplant patients. Pediatr Transplant 2003; 7: 125-9.
  15. de Vries HJ, Teunissen MB, Zorgdrager F, Picavet D, Cornelissen M. Lichen planus remission is associated with a decrease of human herpes virus type 7 protein expression in plasmacytoid dendritic cells. Arch Dermatol Res 2007; 299(4): 213-9.
  16. Moravvej H, Abolhasani E, Rahimi H, AlirezaeiP, Mahmoudi-Rad M, Keyvani H. Lichen planus is not associated with human herpesvirus type 7. Br J Dermatol 2012; 167(4): 960-1.
  17. Levy JA. Three new human herpes viruses (HHV-6, 7, and 8). Lancet 1997; 349: 558-62.
  18. Mikhko T, Xueyi Z, Hirokatsu Y, Noritaka O, Kazhou T. Detection of herpes virus genomes in skin lesions from patients with behc¸et’s disease and other related inflammatory diseases. Acta Derm Venereol 2003; 83(2): 124-7.
  19. Scully C. Oral and Maxillofacial Medicine: The Basis of Diagnosis and Treatment. 3rd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; 2008. P. 192-9.
  20. Bolognia L, Joseph L, Ronald P. Dermatology. 2nd ed. St. Louis: Mosby Co; 2008. P. 123-9.