بررسی اثر القاء استخوان سازی ترکیبات Statin در rat

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار بخش پریودنتولوژی دانشکده دندانپزشکی همدان

2 دانشیار بخش پاتولوژی دانشکده دندانپزشکی شهیدبهشتی تهران

3 دندانپزشک

چکیده

مقدمه:
مطالعاتیکه تاکنون در رابطه با تاثیر مصرف سیستمیک ترکیبات استاتین بر روی بافت استخوانی انجام شده، نتایج ثابت و یکسانی را به دنبال نداشته است. لذا بر آن شدیم با توجه به تاثیری که این ترکیبات بر روی بافت استخوانی دارند، اثر القاء استخوان سازی این ترکیبات را در نواحی که به طور طبیعی استخوان وجود ندارد مثل عضله و بافت زیر پوستی، در موش صحرایی ارزیابی کنیم.  
مواد و روشها:
نوع تحقیق تجربی با تکنیک مشاهده‎ای می‎باشد. در این تحقیق مجموعاً 68 تزریق از ترکیبات محلول Atorvastatin، Lovastatin، Simvastatin  به غلظت mg/ml 1 در پلی‎اتیلن‎گلیگول 300، در زیر پوست ناحیه پشتی و در عضلات دست و پای موش صحرایی تزریق گردید. بعد از گذشت 6 هفته  موش ها کشته شده و از نواحی تزریق شده، نمونه تهیه شد. سپس مقاطع در زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفتند.
 
 
یافته‎ها:
در دو نمونه کانون های استخوانی به صورت مخلوطی از استخوان لاملار و woven دیده شد که اطراف این کانونها ریم استئوبلاستی فعال نیز قابل رویت بود. در یک نمونه دیگر کانونی از بافت غضروفی دیده شد که اطراف آن بافت همبندی مزانشیمال فعال، در حال تمایز به غضروف دیده می‎شد.
نتیجه‎گیری:
یافته‎های این تحقیق و تمایز تدریجی بافت عضلانی به بافت Stem استخوانی در اطراف نمونه‎ها، تایید کننده احتمال اثر القاء استخوان سازی این ترکیبات می‎باشد ولی جهت تایید بیشتر، پیشنهاد می‎شود این اثر در مطالعات دیگر نیز به ارزیابی گذاشته شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Assessment of osteoinduction by statins in rat

نویسندگان [English]

  • Behzad Hushmand 1
  • Behnam Eslami 2
  • Shohreh Amooie 3
1 Assistant Professor, Dept of Periodontology, School of Dentistry, Hamedan University of Medical Sciences, Hamedan, Iran.
2 Associate Professor, Dept of Pathology, School of Dentistry, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran.
3 Dentist
چکیده [English]

Introduction:
To date, studies about the systemic effects of statins on bone tissue have led to different resuts. The aim of this study was to assess the osteoinductivity by  statins when injected intramuscularly or subcutaneously in rats.
Materials & Methods:
In this experimental study, 68 injections of Simvastatin, Lovastatin, Atorvastatin in polyethyleneglycole with 1mg/ml and polyethyleneglycole 300 were injected either S.C in rat`s backs or I.M into their hand and foot. After 6 weeks, the rats were killed and samples of the injection areas were provided and were studied under a microscope.
Results:
In two of the samples, few bony areas were seen which were a mixture of lamellar and woven bone. Around these areas’ an osteoblastic rim was visible. In another sample, a chondral area with an active mesanchimal connective tissue which was in a differentiation state to become cartilage, was seen.
Conclusion:
Finding of this study and the gradual differentiation of muscular tissue to bony stem tissue in around samples, confirms the probable osteoinductivity effect of theses compound. To confirm further we propose that this effect should be investigated on stem cell cultures, in vitro.       

کلیدواژه‌ها [English]

  • Rat
  • Osteoinduction
  • Simvastatin
  • Lovastatin
  • Atorvastatin

مقدمه:

تحلیل استخوان آلوئول در پی فرآیندهای مختلفی (به عنوان مثال بیماریهای پریودنتال، از دست رفتن دندان، ترومای ناشی از جراحی استخوان یا تهیه حفره برای ایمپلنت....) رخ می‎دهد. بازسازی و ترمیم استخوان از دست رفته در انسان، خواه ناشی از علل فیزیولوژیک و خواه به سبب عوامل پاتولوژیک، یکی از انگیزه‎های جراحان از زمانهای دور بوده است. آنان پیوسته در جستجوی راه و یا ماده‎ای بوده‎اند که بتواند به عنوان جانشین مناسب، چه از نظر مورفولوژی و چه از نظر فانکشن، نقایص استخوانی را برطرف کند(1).

پیوند استخوان اتوژن جهت ترمیم قسمتهای از دست رفته، یکی از روشهای رایج درمانی است. منتهی لازم است جراحی در دو و یا چند منطقه بدن انجام شود که طبعاً برای بیمار مشکلات زیادی در پی دارد. پیوند قطعات استخوانی آلوژنیک نیز یکی از روشهای پیشنهادی است. این شیوه اگرچه مشکلات درمان قبلی را ندارد ولی احتمال تشکیل کانون های عفونی،
واکنش های ایمونولوژیک و پس زدن بافت پیوندی وجود دارد(3و2).

با عطف به این مشکلات خاص، از دهه 1980 به بعد استفاده از هیدروکسی آپاتایت و مواد آلوپلاستی دیگر در جراحی‎های مختلف بخصوص جراحی‎های دهان و فک و صورت، رواج یافته است. معهذا به دلیل گرانی و کمبود این مواد بویژه هیدروکسی‎آپاتایت و همچنین نداشتن ویژگی های یک بافت استخوانی مناسب، به ناچار محققان به دنبال استفاده از شیوه‎های دیگری به منظور جبران نقایص استخوانی بوده‎اند(5و4).

از راههای دیگر درمانی پیشنهاد شده، می توان از خاصیت القاء استخوان‎سازی بافتهای مختلف نام برد که احتمال آن در قطعات دندانی از سایر بافت ها (غیر از استخوان) بیشتر است(6).

همچنین می توان به خاصیت القاء استخوان سازی ترکیبات مختلف از جمله BMP[1]S (پروتئین‎های مورفوژنز استخوان) اشاره کرد. اولین کسی که به خاصیت القاء استخوان توسط BMPS پی برد، Urist در سال 1968 بود. مطالعات متعدد Urist  نشان داد که با کاشتن BMP در عضله rat، تشکیل استخوان تقویت می‎شود. این پدیده به علت آن است که این مواد به طور موضعی عمل کرده و باعث تحریک و تغییر فیبروبلاست های بافت همبندی میزبان به کندروبلاست یا استئوبلاست شده و در نتیجه باعث تشکیل استخوان می گردد(10-7).

مطالعاتی که تاکنون در رابطه با تاثیر مصرف سیستمیک ترکیبات استاتین بر روی بافت استخوانی انجام شده نتایج ثابت و یکسانی را به دنبال نداشته است. لذا بر آن شدیم با توجه به تاثیری که این ترکیبات بر روی بافت استخوانی دارند، اثر القاء استخوان سازی این ترکیبات را در نواحی که به طور طبیعی استخوان وجود ندارد مثل عضله و بافت زیرپوستی، در موش صحرایی ارزیابی کنیم.  

مواد و روش ها:

تحقیق حاضر که تجربی – مشاهده ای بود بر روی 10 موش صحرایی (rat) نر  با وزن متوسط حدود 250 گرم و سن حدود 16 هفته و 10 موش صحرایی ماده با وزن متوسط حدود 300 گرم و سن حدود 16 هفته انجام شد. حجم نمونه در مطالعه حاضر با استفاده از مطالعات مشابه انتخاب گردید. کلیه این موش‎ها از نژادSprague –Dowely بوده و از انیستیتوپاستور خریداری شده بودند. موش‎ها به طور تصادفی در 7 گروه مختلف قرار داده شدند. لازم به ذکر است که موش‎های نر و ماده‎ایی که در یک گروه قرار می‎گرفتند، در قفسه‎های جداگانه نگهداری می‎شدند. ابتدا فرم پودری ترکیبات استفاده شده در این مطالعه بر اساس منوگراف‎های USP26 و با استفاده از
پلی‎ اتیلن ‎گلیکول 300 به فرم تزریقی تبدیل شد. سپس تک تک ratها با استنشاق گاز ناشی از cc2 هالوتان مایع ظرف مدت 2 دقیقه در اتاقک مخصوص بیهوشی حیوانات، بیهوش گردیدند. در گروه 4 تایی اول در ناحیه زیر پوست پشت rat، چهار تزریق از محلول ترکیبات Simvastatin Atorvastatin , ،Lovastatin  و پلی‎اتیلن‎گلیکول به میزان  ml5/0 به ترتیب در 4 ناحیه: چپ بالا، راست بالا، راست پایین، چپ پایین تزریق شد. در گروه 4 تایی دوم یکrat  به علت  overdoseشدن ماده استنشاقی مرد و در بقیه ratها، همین مقادیر در نواحی فوق‎الذکر به صورت زیرپوستی تزریق گردید منتهی به صورت چرخشی محل تزریق مواد تغییر می‎کرد. به طوری که در این گروه Atorvastatin، Lovastatin، Simvastatin و پلی‎اتیلن‎گلیکول به ترتیب در نواحی راست بالا، راست پایین، چپ پایین و چپ بالا تزریق شدند. در گروه 4 تایی سوم، به همان صورت عمل شده و با تغییر چرخشی در محل‎های فوق، همان مقادیر از ترکیبات فوق تزریق گردید. در این گروه دو rat ماده و دو rat نر قرار گرفت که در قفس‎های جداگانه‎ای نگهداری شدند. در گروه چهارم که شامل 2 rat بود، در عضلات ران و بازوی موش‎ها،  ml5/0 محلول Atorvastatin تزریق شد. در گروه پنجم که شامل دو rat بود، یک  rat به علت overdoseشدن ماده استنشاقی مرد و در عضلات ران و بازوی rat دوم ml5/0 محلول Simvastatin تزریق شد. در گروه دوتایی ششم، در عضلات ران و بازوی موشها ml 5/0 محلول Lovastatin تزریق شد. در گروه هفتم که شامل دو rat بود، یک  ratبه علت overdose شدن ماده استنشاقی مرد و در عضلات ران و بازوی rat دیگرml 5/0 پلی‎اتیلن‎گلیکول تزریق شد. نهایتاً 3 rat از مطالعه خارج شدند. برای تعیین محل‎های تزریق و نوع ماده تزریقی، از ماژیک های رنگی که اثرشان پاک نمی‎شود، استفاده شد. به طوری که هر رنگ نمایانگر یک ترکیب تزریق شده بود. (مثلاً رنگ سرخ نماینده تزریق Simvastatin و رنگ آبی نماینده تزریق Atorvastatin و ... بود) در صورت لزوم، رنگ کردن محلهای قبلی تجدید می‎شد. ratها در قفس‎های مخصوص نگهداری حیوانات قرار گرفته و بر روی هر قفس مشخصات تزریقات نوشته شد.

لازم به ذکر است از تزریق پلی‎اتیلن‎گلیکول به عنوان شاهد، به منظور بررسی این نکته که استخوان ایجاد شده به دلیل خاصیت استخوان سازی ترکیبات استاتینی است یا به علت ترومایی که به محل وارد شده است و همچنین برای تعیین اینکه پلی‎اتیلن‎گلیکول،
حلال ماده اصلی اثری بر عملکرد ترکیب اصلی نداشته است، استفاده شد. در روزهای پس از عمل به حیوانات غذای مخصوص موش داده شد و از لحاظ ظاهری بررسی می‎شدند. به ظاهر تغییری در عملکرد دست و پای ratها مشاهده نشد.

پس از گذشت 42 روز rat های گروه های 7 گانه فوق، به صورت جداگانه با استنشاق گاز ناشی از  cc3 هالوتان مایع در اتاقک مخصوص بیهوشی حیوانات sacrificed شدند و سپس محل‎های شامل تزریق به صورت مجزا با بیستوری و قیچی جراحی از سایر قسمتها جدا شد. در ناحیه پشت پس از آنکه با بیستوری برشی داده شد، با استفاده از قیچی، پوست جدا شده و ناحیه زیرپوستی محل تزریق با بیستوری و قیچی جدا گردید. تمام نمونه‎های تهیه شده به طور جداگانه‎ای در ظروف پلاستیکی درب‎دار حاوی فرمالدئید 10% خنثی قرار داده شد و بر روی هر ظرف اتیکتی شامل مشخصات آن از قبیل محل تزریق و نوع ماده تزریقی چسبانده شد. نمونه‎ها به مرکز پاتولوژی دانشگاه شهید بهشتی تهران ارسال گردید.  بعد از طی مراحل لابراتواری و تهیه 5 تا 10 مقطع به ضخامت 5 میکرون از هر نمونه 670 لام تهیه شد و توسط پاتولوژیست دهان با میکروسکوپ NIKON مدل
Y-THM زیر نور پلاریزه بررسی شده و با دوربین دیجیتال FUJIX مدل HC-300 ZI عکسبرداری گردید و در برنامه فتوشاپ بررسی شد.

یافته‎ها:

در بررسی برش های میکروسکوپی تهیه شده، در 3 نمونه وجود ماده سخت ردیابی شد. در سایر نمونه‎ها نتوانستیم ماده سخت را ردیابی کنیم و علائمی از التهاب و سایر متغیرها دیده نشد.

از 3 نمونه فوق‎الذکر، در نمونه حاصل از تزریق زیرپوستی محلول Simvastatin در ناحیه پشت rat، بافت غضروفی دیده شد. التهاب و سلول ژیانت و گرانولوم جسم خارجی مشاهده نگردید. در اطراف این کانون غضروفی، بافت همبندی مزانشیمال فعال، در حال تمایز به غضروف دیده ‎شد.

 

 

 

تصویر 1 : هیستولوژیک غضروف تشکیل شده در محل تزریق Simvastatin

 

در نمونه دیگری که از محل تزریق زیرپوستی  محلول Simvastatin در ناحیه پشت موش دیگری تهیه شده بود، دو کانون بافت سخت تشکیل شده بود که کاملاً استخوانی بودند و  حدود 5%  آن را غضروف  و 95% آن را بافت استخوانی به صورت مخلوطی از استخوان لاملار و woven تشکیل می داد. در اطراف ناحیه استخوانی،ریم استئوبلاستی فعال به همراه سلول ژیانت (به شکل منفرد) دیده شد.

در لامی که از محل تزریق Lovastatin در پشت rat تهیه شده بود، دو کانون از ماده کلسیفیه سخت شامل 5% بافت غضروفی و 95% استخوان به صورت مخلوطی از استخوان لاملار و woven تشکیل شده بود. در اطراف این نواحی استخوانی ریم استئوبلاستی فعال مشهود بود و در یک کانون، در مرکز آن بافتی مشابه با مغز استخوان تشکیل گردیده بود. در این لام التهاب، سلول ژیانت و گرانولوم جسم خارجی دیده نشد. نتایج فوق به صورت خلاصه در جدول 1 آمده است.

 


 

 

جدول 1 : توصیفی لام هایی که تغییرات بافتی را از خود نشان داده اند.

نوع ماده

تزریقی

ناحیه تزریق

ماده

کلسیفیه

نوع استخوان

التهاب

گرانولوم جسم خارجی

سلول ژیانت

ریم‎استئوبلاستی فعال

Simvastatin

پشت rat

100% غضروف

----

ندارد

ندارد

ندارد

ندارد

Simvastatin

پشت rat

5% غضروف

95% استخوان

لاملار +

woven

دارد

ندارد

دارد

دارد

Lovastatatin

پشت rat

5% غضروف

95% استخوان

لاملار + woven

ندارد

ندارد

ندارد

دارد


 

 

 


بحث:

مطالعات انجام شده تا به امروز در رابطه با پدیده القاء استخوانسازی توسط عوامل مختلف، بر این اساس استوار بوده است که پیش‎ساز سلولهای استئوبلاستیک که در بافتهای چربی، زیرپوستی، عضله و استخوان یافت می‎شوند، می‎توانند تحت تاثیر این عوامل، به سلولهای استخوانساز (استئوبلاست) تمایز یابند(11). به همین دلیل در مطالعه حاضر، از کاربرد ترکیبات استاتینی در عضله و زیر پوست rat به منظور بررسی پدیده القاء استخوان سازی استفاده گردید. مکانیسمی که به نظر می‎رسد با بررسی به عمل آمده در خواص فارماکوکنتیک دارو در اثراتش بر روند ذکر شده تاثیرگذار باشد، مهار مسیر mevalonate در بخش prenylation  مربوط به GTPaseهای کوچک می‎باشد(12).

با عنایت به اینکه پیدا کردن محل دقیق تزریق دارو در حجم زیاد یک عضله مشکل می‎باشد معهذا نتایج حاصل از برش های بافت شناسی نمونه‎های عضله rat نشان داد که این ترکیبات به ویژه Lovastatin  و Simvastatin احتمالا می‎توانند Osteoinductive باشند، خصوصاً این که در دو نمونه تمایز تدریجی بافت عضلانی به بافت stem استخوانی همراه با ریم استئوبلاستی فعال مشاهده گردید.

با مروری بر منابع موجود مشخص می‎گردد که مطالعاتی در رابطه با مصرف ترکیبات استاتینی با تمرکز بر ویژگی اثر آنها بر بافت استخوانی صورت پذیرفته ولی در رابطه با ویژگی Osteinductivity  به روش صحیح و قابل بررسی علمی، مطالعه ای انجام نشده است. بنابراین در اینجا به نتایج چند مطالعه شاخص که تا حدی هدایت‎گر پژوهشگر به انجام این تحقیق بوده است، اشاره می‎کنیم.

Mundy و همکارانش در سال 1999 در مطالعه‎ای نشان دادند که مصرف سیستمیک Simvastatin می‎تواند بیان BMP-2 را افزایش داده و نتیجه اینکه می‎تواند تشکیل استخوان را گسترش دهد(12).

یافته‎های مطالعه Sugiyama  و همکارانش در سال 2000 نیز این نتایج را تایید کردند(12).

Chan و همکارانش در سال 2000 و Wang و همکارانش در سال 2000 در مطالعات کارآزمایی بالینی خود نشان دادند که ترکیبات استاتین می‎توانند خطر شکستگی hip را در زنان پیر کاهش دهد. همچنین در مطالعه‎ای که به صورت کارآزمایی بالینی توسط Funkhouser و همکارانش در سال 2002 انجام شد، مشاهده گردید که تجویز سیستمیک استاتین می‎تواند تراکم بافت استخوانی را در مردان افزایش داده و خطر استئوپروز را در انسان کاهش دهد(13).

در مطالعه‎ای که توسط Song و همکارانش در سال 2002 انجام شد، گزارش گردید کهSimvastatin  می‎تواند بیان ژن BMP-2 را در محیط کشت سلولهای استرومال مغز  استخوان و همچنین فعالیت آلکالین فسفاتازی آنها را افزایش دهد(14).

در مطالعه‎ای که توسط Ayukawa و همکارانش در سال 2004 انجام شد، مشاهده گردید که تجویز
داخل صفاقی Simvastatin در rat می‎تواند روند
استخوان سازی را در اطراف ایمپلنت‎های تیتانیومی تقویت نماید که نتایج این مطالعه با مطالعه Oxlund در سال 2002 مشابه بود(15).

تقریباً به همان تعداد مقالاتی که تاثیر این ترکیبات را تایید می‎‏کنند، مقالاتی نیز در منابع مشاهده می‎گردند که نتوانسته‎اند تاثیر ترکیبات استاتینی را بر روی بافت استخوانی (به صورت in vivo) به اثبات برسانند، مانند مطالعه Von Stechow  و همکارانش در سال 2003 که شاید یکی از دلایل عمده آن Liver - targeted بودن ترکیبات استاتینی باشد که مانع از رسیدن دارو به بافت استخوانی می‎گردد و بر این اساس پیشنهاد کردند که برای نشان دادن این اثر ترکیبات فوق در    in vivo، فرمول‎بندی آنها باید اصلاح شود(16).

مـطالعاتـی هـم وجــود دارد کــه اثـر الـقاء
استخوان سازی ترکیبات دیگر را به اثبات رسانده‎اند که به چند نمونه آن اشاره می‎کنیم. مطالعه Kubler و Urist در سال 1991 نشان داد که کاشتن BMP به همراه پروتئینهای غیرکلاژنی نامحلول  (NCP)به عنوان حامل در عضله rat منجر به تشکیل ossicle جدید می‎شود(8).

مطالعه Yamanguchi در سال 1991 نشان داد که استفاده از BMP-2 در محیط کشت سلول های مزودرمالی، می‎تواند باعث تمایز سلولهای پره‎کورسور مزانشیمال به سلولهای غضروف‎ساز و استخوان ساز شود (17).

Sigurdsson و همکارانش در سال 1995 طی یک مطالعه کارآزمایی بالینی در سگ نشان دادند که استفاده از rh-BMP در ضایعات استخوانی پریودنتالی ایجاد شده به طریقه جراحی، باعث تقویت تشکیل استخوان می‎گردد(18).

مطالعه Urist در سال 1996 نشان داد که کاشته شدن BMP-2 نوع ترکیبی به همراه ماتریکس استخوانی غیر فعال شده به عنوان حامل، در عضله موشهای بالغ تشکیل استخوان heterotopic (را که شامل فضاهای استخوانی است) القاء می‎کند که نتایج مطالعه 1991 Kubler و Urist را تایید می‎کند(9).

 MurrayوUrist  و همکارانش طی مطالعه‎ای در سال 1997 گزارش کردند که سلول های مزودرمال
چند قوه‎ایی و پره‎استئوبلاست‎های rat در محیط کشت، در پاسخ به BMP به سلولهای استئوبلاست تمایز می‎یابد(10).

نتیجه‎گیری:

 مطالعه حاضر نشان داد که برخی از ترکیبات استاتینی احتمالا می توانند خاصیت القاء کنندگی استخوان سازی را داشته باشند بنابراین توصیه
می گردد که در تحقیقات بعدی با عنایت به نیاز مبرم به این قبیل ترکیبات، ویژگی القاء استخوان سازی، دوز مناسب و موثر بودنش در انسان مورد ارزیابی و تحقیق بیشتر قرار گیرد.



[1]. Bone Morphogenic Protein

  1. Kruger GO. Textbook of oral and maxillofacial surgery. 6th ed. St. Louis: The CV Mosby Co; 1984; P. 106.
  2. Andergg CR. Clinical evaluation of the use of decalcified freeze – dried bone allograft with guided tissue regeneration in the treatment of molar furcation invasions. J Periodontol 1991; 62: 264-8.
  3. Soins ST. Healing of spontaneous periodontal defects in dogs treated with xenogenic demineralized bone. J Periodontology 1985; 56: 470-9.
  4. Wijis F, Putler C, Lange GL. Local residual ridge augmentation with solid hydroxyapatite block. Part 1, An animal experimental. J Prosthet Dent 1993; 69: 510-3.
  5. Green JP, Woino TH. Bone formation in hydroxyapatite orbital implants. Am J Ophthalmol 1995; 120: 981-2.
  6. Urist MR. Inductive substances for bone formation. Clin Orthop Related Res 1968; 59: 59-69.
  7. Lindhe J, Karring T, Lang NP. Regenerative Periodontal therapy in Alveolar Bone Formation: Clinical Periodontology and Implant Dentistry , 4th ed. Copenhagen: Munksgaard; 2003; P. 667, 886.
  8. Kubler N, Urist MR. Allogenic bone and cartilage morphogenesis. Rat BMP in vivo and in vitro, J Craniomaxillofac Surg. 1991; 19(7): 283-8.
  9. Volek – Smith H, Urist MR. Recombinant human bone morphogenic protein (rh BMP) induced heterotopic bone development in vivo and in vitro, Proc Soc Exp Biol Med. 1996; 211(3): 265-72.
  10. Murray SS, Urist MR, Grisanti MS, Bentley GV, Kahn AJ. The calpain-calpastatin system and cellular proliferation and differentiation in rodent osteoblastic cells. Exp Cell Res 1997; 233(2): 297-309
  11. Robert E, Marx , Robert J. Genco, Samuel E. Lynch. Tissue Engineering, 1st ed. London: Quintessene Books; 1999. P. 30,72,83,97,103,125,147,231.
  12. Garrett IR, Mundy GR. The role of statins as potential targets for bone formation. Arthritis Research. 2002; 11: 273-240.
  13. Edwards CJ. Statins and bone morphogenetic proteins: new pathway in bone formation, Ann Acad Med Singapore 2002; 245-7.
  14. Song CL, Dang GT, Guo ZQ. Effect of Simvastatin on bone morphogenic protein-2 expression and alkalin phosphates activity of bone marrow stromal cell. J Bone 2001; 27: 270-75.
  15. Ayukawa ya , Dkamura A. Ayukaway: Simvastatin Promotes Osteogenesis Around titanium Implants. Clin Oral Implants Res 2004; 10: 346-50.
  16. Stechow D, Fish S, Chorev M. Does Simvastatin Stimulate bone formation in vivo? BMC Musculoskeltal Disoreder 2003; 8: 220-23.
  17. Yamaguchi A. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 stimulates osteobalstic maturation and inhibits myogenic differentiation invitro. J Cell Biol 1991; 113: 681-7.
  18. Sigurdsson TJ. Periodontal repair in dogs: recombinant human bone morphogenetic protein-2 significantly enhances periodontal regeneration. J Periodontol 1995; 66: 131-8.