بررسی مقایسه‏ ای تهاجم عصبی و عروقی آدنویید سیستیک کارسینوما و موکواپیدرموئید کارسینومای غدد بزاقی با کاربرد مارکرهای S-100، GFAP، NCAM و PECAM-1

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشیار آسیب شناسی دهان، فک و صورت، مرکز تحقیقات دندانپزشکی دکتر ترابی نژاد و دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان

2 آسیب شناس دهان، فک وصورت

3 دانشیار گروه آسیب شناسی دهان، فک و صورت دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران

چکیده

مقدمه: موکواپیدرموئید کارسینوما ((MEC و آدنویید سیستیک کارسینوما (AdCC) شایع ترین تومورهای بدخیم غدد بزاقی هستند که رفتار بیولوژیک آنها کاملا مشخص نشده است. از عواملی که در رفتار بیولوژیک این تومورها موثر قلمداد شده است، تهاجم اطراف عصبی و عروقی می‏باشد. لذا هدف این مطالعه، بررسی تهاجم اطراف عصبی و عروقی AdCC و MEC غدد بزاقی اصلی و فرعی با استفاده از مارکرهای NCAM، S-100، GFAP به عنوان مارکرهای عصبی و PECAM-1 به عنوان مارکر عروقی بود.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه مقطعی-توصیفی، 20 نمونه AdCC و 20 نمونه MEC غدد بزاقی که با فرمالین ثابت و در پارافین غوطه ور شده بودند، برای بررسی حضور پروتئین‏های S-100،GFAP،NCAM و PECAM-1 به روش Biotin-streptavidin novolink polymer، بازیافت آنتی‏ژنیک و رنگ‏آمیزی ایمونوهیستوشیمیایی شدند و داده‏های بدست آمده با استفاده از آزمون آماری مان-ویتنی و دقیق فیشر تحلیل آماری شدند.
یافته‏ها: تمام نمونه‏های AdCC و MEC به S-100 واکنش داده که بین 1+ تا 4+ متغیر بودند. میزان فراوانی پروتئین S-100 و شدت رنگ‏پذیری آن در AdCC بیشتر از MEC بود (05/0P<). دو مورد AdCC و 9 مورد MEC واکنش 1+ به GFAP نشان دادند که میزان فراوانی و شدت رنگ‏پذیری آن در MEC بیشتر از AdCC بود (013/0P=). هیچکدام از نمونه‏های AdCC و MEC به NCAM و PECAM-1 واکنش نشان ندادند (P=1).
نتیجه گیری: باتوجه به حضور پروتئین S-100 و GFAP در AdCC و MEC، احتمالاً سلول‏های میواپی‏تلیال در هیستوژنز این دو تومور نقش دارند و با توجه به این که تهاجم اطراف عصبی در تومورهای غدد بزاقی به سلول میواپی‏تلیال نسبت داده شده است، الزاماً خصوصیت مزبور نمایانگر پیش‏آگهی ضعیف تر این تومورها نمی‏باشد. در نتیجه‏گیری کلی، با توجه به فقدان بروز مارکر NCAM و PECAM- در AdCC و MEC و سایر یافته‏ها، به نظر نمی‏رسید تهاجم اطراف عصبی و عروقی این دو تومور، تفاوت معنی‏داری داشته باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The Comparative Evaluation of Perineural Invasion and Vascular Invasion in Adenoid Cystic Carcinoma and Mucoepidermoid Carcinoma of Salivary Glands by Expression of S-100, GFAP, NCAM and PECAM-1

نویسندگان [English]

  • Parviz Deyhimi 1
  • Nafiseh ShamlouMahmoudi 2
  • Nosratollah Eshghyar 3
1 Associate Professor of Oral & Maxillofacial Pathology, Torabinegad Dental Research Center and Dental School, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2 Oral & Maxillofacial Pathologist
3 Associate Professor, Dept of Oral & Maxillofacial Pathology, Dental School, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Mucoepidermoid carcinoma (MEC) and Adenoid cystic carcinoma (AdCC) are the most common salivary malignancies, and their biologic behavior has not been completely determined. Perineural and vascular invasion are effective on the biologic behavior. Therefore, the aim of this study was to evaluate perineural and vascular invasion in AdCC and MEC of major and minor salivary glands by expression of neural markers such as S-100, GFAP, NCAM and vascular marker such as PECAM-1.
Materials & Methods: Formalin-fixed and parafin-embedded tissue sections of 20 cases of AdCC and 20 cases of MEC were immunohistochemically analyzed for the presence of S-100, GFAP, NCAM, PECAM-1by biotin streptavidin Novolink polymer procedure after antigen retrieval. Data were analyzed by Mann-Whitney and Fisher's exact tests.
Results: All AdCCs and MECs were positive (+1→+4) for S-100. S-100 positive frequency and severity ratios in AdCC were higher than MEC (P<0.05). Two specimens of AdCC and nine specimens of MEC were positive (+1) for GFAP. GFAP positive frequency and severity ratios in MEC were higher than AdCC (P=0.013). All AdCCs and MECs were negative for NCAM and PECAM-1 (P=1).
Conclusion: The presence of S-100 and GFAP in AdCC and MEC probably indicates the role of myoepithelial cells in histogenesis of theses tumors. Considering that perineural invasion in salivary gland tumors has been ascribed to myoepithelial cell, this characteristic does not necessarily indicate the poor prognosis of these tumors. As a result, according to the lack of expression of NCAM and PECAM-1 in AdCC and MEC and other findings, perineural and vascular invasion in these tumors do not appear to be different significantly.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mucoepidermoid carcinoma
  • Adenoid cystic carcinoma
  • S-100
  • GFAP
  • NCAM
  • PECAM-1
  • perineral invasion
  • vascular invasion

مقدمه

از جمله عوامل موثر در رفتار بیولوژیک و پیش‏آگهی تومورهای بدخیم غدد بزاقی، تهاجم عصبی و عروقی آنها می‏باشد. توانایی این تومورها برای تهاجم عروقی و اطراف عصبی با بروز مولکول‏هایی مرتبط است که مستقیم یا غیرمستقیم در فرآیندهای مزبور نقش دارند. سه مارکر عصبی S-100، GFAP،NCAM  و مارکر عروقی PECAM-1 در این رابطه بیشتر  مورد پژوهش قرار گرفته‏اند.

S-100 یک پروتئین اسیدی Ca-binding است که دارای دو زیرگروه آلفا و بتا می‏باشد و نخستین بار در CNS ایزوله شد و در تنظیم یون‏ها در مغز نقش دارد ولی اختصاص به سلول‏های عصبی نداشته و در هسته و سیتوپلاسم سلول‏های گلیال، ملانوسیت‏ها، کندروسیت‏ها، سلول‏های میواپی‏تلیال غدد بزاقی و سایر سلول‏هاو تومورهای ناشی از این سلول‏ها دیده می‏شود.(2و1)

گلیال فیبریلار اسیدیک پروتئین(GFAP) یکی از پنج فیلامان حد واسط سیتوپلاسمی و مربوط به سلول‏های گلیال است. بروز این مولکول در تومورهای اعصاب محیطی و تومورهای مخلوط (Mixed tumor or Pleomorphic Adenoma) غدد بزاقی گزارش شده است.(3و1)

NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule) یا CD56 که جزو مولکول‏های چسبنده (Adhesion molecules) بوده و در واقع یک مولکول چسبنده سلول‏های عصبی است، به طور طبیعی در نورون‏ها، آستروسیت‏ها، سلول‏های شوان غلاف عصبی، میوبلاست‏ها و لنفوسیت‏های  NK(Natural Killer) یافت می‏شود و در میان تومورها، عمدتاً در کارسینوماهای نورواندوکرین و لنفوماهای NK و در بعضی از مزوتلیوماها بارز می‏شود.(1)

 PECAM-1(Platelete-Endothelial Cell Adhesion Molecule-1) یا CD31 جزو مولکول‏های چسبنده بوده و یکی از مفیدترین مارکرها برای سلول‏های اندوتلیالی است و در بعضی از کارسینوماها به طور کانونی رنگ می‏پذیرد. همچنین توسط سلول‏های نئوپلاستیک در بدخیمی‏های غدد بزاقی بارز شده و در اتصال هموفیلیک سلول‏های تومورال به سلول‏های اندوتلیال درگیر شده و متاستازهای عروقی و لنفاوی را تسهیل می‏نماید.(4و1)

موکواپیدرموئید کارسینوما(MEC)  و آدنوییدسیستیک کارسینوما (AdCC) شایعترین تومورهای بدخیم غدد بزاقی هستند که رفتار بیولوژیک آنها کاملاً مشخص نشده است و مقایسه تهاجم اطراف عصبی و عروقی تومورهای مزبور، می‏تواند در مقایسه رفتار بیولوژیک آنها موثر قلمداد گردد، اگرچه خصوصیات فوق، تنها عوامل موثر در روند بیولوژیک این دو تومور نمی باشند. هدف از تحقیق حاضر بررسی آنتی‏ژن‏های S-100، GFAP، NCAM و PECAM-1 در موکواپی‏درمویید  کارسینوما و آدنویید سیستیک کارسینوما و میزان ارزش تشخیصی این مارکرها در بررسی مقایسه‏ای تهاجم عصبی و عروقی این دو تومور بدخیم می‏باشد. در این مورد تحقیقات مختلفی انجام شده است که به خصوص در مورد تهاجم اطراف عصبی تومورهای غدد بزاقی بوده است.

در سال 1996،Toth  و همکارانش، تمایز سلول‏های شوان را در سلول‏های میواپی‏تلیالی تغییر یافته در آدنوییدسیستیک کارسینوما (AdCC) و پلی مورفوس آدنوکارسینومای درجه کم (PLGA) مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه که از آنتی‏بادی‏های S-100، GFAP، Neuron-specific enolase (NSE) و همچنین رنگ‏آمیزی Solochrome که یک رنگ‏آمیزی اختصاصی برای میلین است استفاده گردید، قویاً پیشنهاد شد که تمایز عصبی یا تغییر سلول شوان در این تومورها روی می‏دهد که در واقع مربوط به سلول‏های میواپی‏تلیال تغییر شکل یافته در آنها می‏باشد. اگرچه با توجه به بررسی‏های گذشته مشخص شده بود که سلول‏های میواپی‏تلیال تغییرشکل یافته، خصوصیاتی از انواع مختلف سلول‏ها دارا می‏باشند، ولی خصوصیات بافت عصبی در آنها یافت نشده بود. بررسی Toth مشخص نمود که سلول‏های میواپی‏تلیال تغییرشکل یافته به سلول‏های شوان تمایز می‏یابند که احتمالاً اساس تهاجم اطراف عصبی در این تومورها می‏باشد.(5)

در بررسی Gandour-Edwards در سال 1997 نیز مشخص شد NCAM در 89% AdCCهایی که تهاجم اطراف عصبی نشان می‏دادند، بروز یافته بود که موید این فرضیه بود که تمایز سلول‏های شوان در سلول‏های میواپی‏تلیال تغییرشکل یافته AdCC روی می‏دهد که موجب تهاجم اطراف عصبی و یا به ندرت داخل عصبی می‏گردد.(6)

با وجودی که تهاجم اطراف عصبی در تومورهای بدخیم غدد بزاقی به سلول‏های میواپی‏تلیال تغییر شکل یافته به سلول‏های شوان غلاف عصبی نسبت داده شده است، ولی تهاجم اطراف عصبی در تومورهای بدخیم غیر غدد بزاقی مانند SCC و کارسینوم پروستات نیز مطرح شده است.

 در سال 1999، Mclaughlin و همکارانش بر روی تظاهر NCAM در SCC سر و گردن تحقیقی را انجام دادند. در این تحقیق نتیجه گیری شد که یک ارتباط مثبت بین حضور NCAM و تهاجم عصبی در SCC سر و گردن وجود دارد (002/0=P). بروز این مولکول چسبنده به وسیله سلول‏های تومور ممکن است هم چسبندگی هموفیلیک سلول به سلول وهم چسبندگی هتروفیلیک سلول به ماده زمینه را تسهیل نماید و بدین وسیله سلول‏های تومور را قادر می‏سازد که از بافت‏های اطراف عصبی، سلول‏های عصبی یا هر دو به عنوان یک مجرا برای گسترش اطراف عصبی استفاده نمایند. با این وجود در بررسی مزبور، هیچ ارتباط مهمی بین حضور تهاجم عصبی یا واکنش مثبت در رنگ‏آمیزی با عود ناحیه ای، متاستاز دوردست یا بقاء بیمار دیده نشد، اگرچه مدت متوسط پی گیری فقط 6/13 ماه بود.(7)

در تمایز با بررسی Mclauglin، در سال 2000 Vural، Hutcheson و دیگر همکارانشان تهاجم اطراف عصبی را در SCC، یک عامل پیشگویی کننده ضعیف در ارتباط با افزایش خطر عود موضعی، متاستاز عقده‏ای (Nodal) و کاهش بقای بیماران مبتلا به SCC سروگردن تلقی نمودند. در این بررسی که بر روی ارتباطNCAM و گسترش عصبی SCC سر و گردن انجام شد، تفاوت در بروز NCAM بین گروه مطالعه دارای تهاجم اطراف عصبی و گروه کنترل بدون تهاجم اطراف عصبی از نظر آماری معنی‏دار بود (01/0>P)(8)، ولی همین محققین یعنی Hutcheson، Vural و دیگر همکارانشان در سال 2000 بر روی تظاهر NCAM در AdCC‏های سرو گردن و ارتباط آن با گسترش اطراف عصبی بررسی مشابهی انجام دادند و پیشنهاد کردند که استفاده از بروز NCAM به عنوان یک عامل پیشگویی‏کننده برای تهاجم اطراف عصبی AdCC بسیار غیرمحتمل می‏باشد.(9) در ارتباط با بررسی فوق، در پژوهش دیگری که توسط Van der wal و همکارانش در سال 1990 برای حضور تهاجم اطراف عصبی در ارتباط با مکان اولیه، اندازه، گسترش موضعی، وضعیت هیستولوژیک حواشی جراحی و انتشار متاستاتیک AdCC‏های داخل دهانی که ابتدائاً به وسیله جراحی با یا بدون رادیوتراپی بعد از عمل درمان شده بودند، انجام گردید، هیچ ارتباطی بین تهاجم اطراف عصبی و محل اولیه یا اندازه تومور یافت نشد، اگرچه تهاجم اطراف عصبی بیشتر در تومورهایی که گسترش موضعی داشتند و در مواردی که حواشی جراحی، شواهد مثبت از تومور را نشان می‏دادند، رخ داده بود. به علاوه از نظر آماری ارتباط معنی‏داری بین تهاجم اطراف عصبی و متاستاز دوردست وجود نداشت.(10)

مشابه نتایج بدست آمده در مورد SCC، Thurairaja و همکارانش در سال 2006، مطالعه‏ای را برای مشخص کردن ارتباط بین تهاجم اطراف عصبی یا عروقی با متاستازهای اولیه استخوانی در بیماران مبتلا به سرطان پروستات انجام دادند. در این بررسی، تهاجم اطراف عصبی به طور قابل ملاحظه‏ای با متاستازهای اولیه استخوانی مرتبط بود، در حالی این یافته در مورد تهاجم عروقی صادق نبود. لذا نتیجه گیری شد که ممکن است تهاجم اطراف عصبی یک عامل پیشگویی‏کننده مهم در متاستازهای اولیه استخوانی سرطان پروستات باشد.(11)

از آنجائی که آدنویید سیستیک کارسینوما یک میل ترکیبی مهم برای بافت‏های غنی از غشاء پایه مانند لامینین دارد، در سال 2000، Franca و همکارانش مطالعه‏ای را بر روی نقش پروتئین‏های غشاء پایه در تظاهر NCAM بر روی دودمان سلول‏های آدنوییدسیستیک کارسینومای بروز دهنده NCAM (CAC2) انجام دادند. نتایـج این بررسی نـشان داد که سلول‏های آدنوییدسیستیک کارسینومای کشـت داده شده، NCAM را بروز داده و این بروز توسط ماتریکس خارج سلولی تنظیم می‏شود. لذا به وسیله تغییراتی در توزیع NCAM روی سلول‏های درمان شده با لامـینین، نقشـی برای NCAM در مـهاجرت سـلـول‏های

آدنویید سیستیک کارسینوما پیشنهاد گردید.(12)

علاوه بر NCAM، مارکرهای دیگر عصبی مانند Brain-Drived Neurotrophic Factor (BDNF) که یک عامل رشد در عصب زایی است، توسط Kowalski و Paulino در سال 2002 در  AdCCمورد بررسی قرار گرفته است. براساس نتایج به دست آمده در این مطالعه، BDNF به طور یکنواخت و با شدت‏های مختلف در AdCC بارز شده و ممکن است در تمایل آن برای تهاجم عصبی نقش داشته باشد.(13)

در سال 2004، Perschbacherو همکارانش بر روی بروز و توزیع PECAM-1 ،NCAM،  (CD45) ICAM[1] و (CD44) HCAM[2] در غدد بزاقی طبیعی و تعدادی از بدخیمی‏های غدد بزاقی و تاثیر آنها بر تهاجم عصبی، تهاجم عروقی، عود تومور و بقاء بیمار، مطالعه‏ای انجام دادند و نتیجه گیری کردند کهNCAM (CD56) مشابه NSE،S-100  و GFAP ممکن است توسط سلول‏های میواپی‏تلیال تغییر شکل یافته نئوپلاستیک بارز شود و این بروز هیچ ارتباطی با حضور هیستولوژیک تهاجم عصبی یا رفتار تومور ندارد، به دلیل اینکه پژوهشگران مزبور قادر به مشاهده هم زمان تظاهر NCAM در اعصاب و سلول‏های تومورال که در تماس با اعصاب هستند، نبودند که یافته مزبور، مطرح‏کننده آن است که درگیری NCAM از طریق اتصال هموفیلیک در تهاجم عصبی ایجاد شده، نمـی‏باشد.(4) این نتایـج در تـمایز با یـافته‏هـای Vural و

Mclauglin در مورد SCC می‏باشدکه ارتباط مستقیمی بین رنگ‏پذیری ایمونولوژیک NCAM و تهاجم اطراف عصبی و رفتار بیولوژیک تومور یافتند.

در این بررسی،PECAM-1  (CD31) به ندرت توسط سلول‏های نئوپلاستیک غدد بزاقی بارز شده اما بروز آن در یک نمونه با متاستاز عروقی مشاهده شد. همچنین حضور آن در سه مورد از تومورهای بدخیم غده بزاقی مورد مطالعه با متاستاز و پیش‏آگهی ضعیف بیمار در ارتباط بود. البته مطالعات بیشتری برای تایید این مشاهدات لازم می‏باشد. همچنین هیچ ارتباط مشخصی بین تظاهر HCAM و ICAM-1 با تهاجم عصبی، تهاجم عروقی یا رفتار بیولوژیک تومور یافت نشد.(4)

در سال 2006،Sun  و همکارانش مطالعه‏ای را بر روی بروز توام مارکر سلول شوان (GFAP) و مارکر سلول میواپی‏تلیال (α-smooth muscle actin) با استفاده از روش ایمونوهیستوشیمیAvidin-Biotin-Peroxidase complex  ََ(SABC) Strept-، ایمونوفلوروسانس هیستوشیمی دوگانه (double label hmmunofluorescence histochemistry)، لیزر اسکنینگ میکروسکوپ هم کانون(Confocal laser scanning microscope) در AdCC انجام داده و ارتباط این مارکرها را با تهاجم اطراف عصبی در این تومور مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه، تمام نمونه‏ها به هر دو مارکر GFAP و α-SMA واکنش مثبت نشان دادند که هردو مارکر در سیتوپلاسم سلول‏های انکومیواپی‏تلیال بارز شدند. براساس این یافته‏ها، نتیجه‏گیری شد که امکان دارد تمایز سلولی شوان در سلول‏های انکومیواپی‏تلیال AdCC رخ دهد که شاید اساس پاتولوژیکال تهاجم عصبی در این تومور باشد.(14)

 

 

در همان سال 2006، Luo و همکارانش به وسیله روش‏های مذکور، نقش تمایز سلولی شوان را با استفاده از مارکرهای سلول شوان GFAP و S-100 در تهاجم عصبی AdCC و MEC غده بزاقی مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه، موقعیت فراساختاری S-100 و GFAP به وسیله ایمونوالکترون میکروسکوپ و بروز توام S-100 و Muscle actin به وسیلهDouble fluorescence immunostain و لیزر اسکنینگ میکروسکوپ هم کانون(CLSM)  مورد پژوهش قرار گرفت. یافته‏های بدست آمده، اختلاف معنی‏داری را در میزان تهاجم عصبی و بروز S-100 و GFAP بین AdCC و MEC نشان می‏داد. در واقع تهاجم اطراف عصبی در 55% AdCCها و صفر درصد MECها و نیز بروز S-100 و GFAP در بیشتر AdCCها، اما هیچیک از MECها یافته شد. به عبارت دیگر، یک ارتباط قوی بین تمایز سلولی شوان و تهاجم عصبی به دست آمد و مشخص شد که تمایز سلولی شوان در سلول‏های میواپی‏تلیال تغییر شکل یافته AdCC رخ می‏دهد، به دلیل اینکه خصوصیات فراساختاری سلول‏های S-100+ و GFAP+ با خصوصیات سلول‏های میواپی‏تلیال تطابق داشت. Double fluorescence immunostain نیز نشان داد که S-100 و Muscle actin در همان نوع سلول‏های AdCC نمایان شده بود. بنابراین تصور می‏شود که تمایز سلولی شوان در سلول‏های میواپی‏تلیال تغییر شکل یافته ممکن است اساس هیستولوژیک تهاجم عصبی Adcc باشد.(15)

در سال 2007، Shang و همکارانش بروز Neural cell adhesion molecule (NCAM) در آدنوییدسیستیک کارسینوما و ارتباط آن را با تهاجم عصبی مورد مطالعه قرار دادند. در این پژوهش، حساسیت  NCAMبرای تهاجم اطراف عصبی، 73% و ویژگی آن برای تهاجم اطراف عصبی، 75% بود. بنابراین بر اساس این مطالعه بروز NCAM می‏تواند به میزان معینی به عنوان یک فاکتور پیش‏گویی‏کننده در تهاجم عصبی آدنوییدسیستیک کارسینوما مطرح باشد. به علاوه، متاستاز عقده لنفاوی می‏تواند به عنوان یک شاخص کلینیکی برای تهاجم اطراف عصبی و بروز NCAM در نظر گرفته شود.(16)

مواد و روش‏ها

مطالعه انجام شده از نوع توصیفی-تحلیلی بود که در آن پرونده 26 بیمار مبتلا به آدنوییدسیستیک کارسینوما و 57 بیمار مبتلا به موکواپیدرموئیدکارسینوما از آرشیو بخش آسیب‏شناسی دهان دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران بین سال‏های 87-76 مورد مطالعه قرار گرفت و از آن میان، با توجه به حجم نمونه که بر اساس بررسی مقالات و مشاوره آماری تعیین گردید، 20 مورد از تیپیک‏ترین نمونه‏های هر یک از تومورهای MEC و AdCC، براساس معیارهای زیر انتخاب شدند و بلوک‏های پارافینی آنها از آرشیو استخراج گردیدند و برش‏های جدیدی برای رنگ‏آمیزی H&E به منظور تایید تشخیص‏های قبلی و نیز اطمینان از کافی بودن نمونه‏ها برای آزمایش‏های تکمیلی مورد نظر به عمل آمد. به علاوه، درجه تمایز تومورهای MEC و نیز طرح هیستولوژیک AdCCها در لام‏های H&E تعیین گردید. همچنین برش‏هایی برای رنگ‏آمیزی اختصاصی PAS از بلوک‏های پارافینی MEC با درجه بالا انجام شد.

الف- معیارهای ورود به مطالعه

1. نمونه‏ها تحت جراحی کامل قرار گرفته باشند.

2. تومور اولیه باشد.

3. طبق تعریف Neville خصوصیات میکروسکوپیک آدنـوییدسیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید کارسینوما

را داشته باشند.(17)

ب- معیارهای خروج از مطالعه

  1. 1.      بیوپسی اینسیژنال باشد.
  2. 2.      تومور اولیه نباشد (عود باشد).
  3. 3.      نمونه‏ها از نظر تشخیص هیستوپاتولوژیک مشکوک باشند.
  4. 4.      نمونه‏ها ثبوت (Fixation) نامناسب داشته باشند.
  5. 5.      نمونه‏ها واجد خونریزی، نکروز و التهاب فراوان باشند.

اطلاعات مندرج در پرونده بیمارانی که دارای ویژگی‏های فوق بوده استخراج شدند. این اطلاعات شامل سن، جنس، محل، اندازه ضایعه، متاستاز به عقده‏های لنفاوی و متاستاز دور دست بودند. متاسفانه به علت اطلاعات ناقص در مورد آدرس و تلفن بیماران و محدودیت در یافتن آنها و وضعیت کنونی بیماریشان، جستجوی متاستاز در سال‏های بعد از درمان اولیه امکان‏پذیر نشد.

به منظور تشخیص وجود آنتی‏ژن‏های مورد نظر در این تحقیق از روش Novolink Polymer Detection System Biotin-Streptavidin به علت حساسیت و دقت بالای آن نسبت به سایر روش‏ها استفاه شد، بدین صورت که از بلوک‏های پارافینی مربوط به هر یک از نمونه‏ها، 5 برش به ضخامت  تهیه گردید و سپس مقاطع نمونه‏ها بر روی لام‏هایی آغشته به Poly-L-lysin به منظور جلوگیری از کنده شدن بافت قرار داده شد.(18)

لام‏های تهیه شده در دمای °c 60-58 در فور به مدت 40 دقیقه قرار داده شدند. آنگاه در سه تغییر گزیلل هر یک به مدت 5 دقیقه به منظور پارافین‏زدایی و پنج تغییر الکل (100،100، 95، 85، 75) به منظور آب‏دهی مجدد تا
آب مقطر عمل آورده شدند.(19)

در این مرحله نمونه‏ها در محلول بافر سیترات با 6=PH به منظور ثابت کردن آنتی‏ژن‏ها قرار داده شدند و این مجموعه در مایکروویو (750=W) به مدت 20-15 دقیقه قرار گرفت تا ساختمان مولکولی آنتی‏ژن‏ها که به دلیل فیکساسیون تغییر شکل یافته بود به وسیله حرارت کنترل شده به حالت طبیعی برگردد. سپس نمونه‏ها به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق سرد شدند.(17)

 در مرحله بعدابتدا تمامی نمونه‏ها به محلول (Phosphate buffered saline (PBS منتقل شده و سپس به مدت 5 دقیقه در هیدروژن پراکساید 3% جهت متوقف کردن فعالیت پراکسیداز اندوژن انکوبه گردیدند.(18و3)

به منظور جلوگیری از رنگ‏آمیزی کاذب در زمینه از محلول (RE7102) Protein Block به مدت 5 دقیقه استفاده شد و سپس نمونه‏ها با آب مقطر و محلول PBS شستشو داده شده و به مدت 10 دقیقه با تریپسین (3/7=PH 1/0% Trypsin) انکوبه گردیدند. این آنزیم موجب رنگ‏پذیری بهتر از طریق تکمیل و تسریع واکنش‏ها می‏شود.(18)

بعد از شستشوی نمونه‏ها با محلول PBS، لام‏ها به مدت یک ساعت در محلول آنتی‏بادی قرار داده شدند. آنتی‏بادی‏های مورد استفاده به شرح زیر بودند:

 

S-100 Lyophilised Monoclonal (Ncl-S-100) Clone S1/61/69 با رقت 1:100

GFAP Lyophilised Monoclonal (Ncl-GFAP-GA5) Clone GA5 با رقت 1:100

PECAM-1 Lyophilised Monoclonal (Ncl-CD31-1A10) Clone1A10  با رقت 1:100

NCAM Liquid Monoclonal (Ncl-L-CD56- 1B6) Clone1B6 (RTU)استفاده مستقیم

 

پس از طی شدن زمان لازم، لام‏ها مجدداً با محلول PBS به مدت 5 دقیقه شستشو داده شده و سپس به مدت 30 دقیقه در محلول (RE 7111) Post primary block قرار گرفتند. (این
محلول یک آنتی‏بادی بر علیه آنتی‏بادی اولیه با منشا

Rabbit-mouse می‏باشد).

در این مرحله آنتی‏بادی و محلول Post primary block کمپلکس ایجاد می‏کنند. سپس لام‏ها به مدت 5 دقیقه با محلول PBS شستشو داده شده آنگاه لام‏ها در محلول
(RE 7112) Novolink polymer به مدت 30 دقیقه قرار گرفته و مجدداًً با محلول PBS به مدت 5 دقیقه شستشو داده شدند. محلول Novolink polymer در مقایسه با روش بیوتین استرپتاویدین، جایگاه‏های بیشتری برای واکنش دارد و باعث افزایش دقت و حساسیت می‏گردد.

در نهایت نمونه‏ها به مدت 5 دقیقه در کروموژن دی آمینو بنزیدین (DAB) رقیق شده، انکوبه گردیده و سپس با آب مقطر شستشو داده شدند.

در این مرحله درصورتی که آنتی‏ژن موردنظر در بافت وجود داشته باشد، به رنگ قهوه‏ای مشاهده می‏شود. سپس تمامی نمونه‏ها توسط هماتوکسیلین به منظور رنگ‏آمیزی مناسب زمینه، رنگ‏آمیزی شدند.(19)

در مرحله نهایی نمونه‏ها در الکل با درجات مختلف به منظور آب‏گیری و سپس گزیلول به منظور شفاف‏سازی قرار داده شدند و نهایتاً با P.V.mount مانت شدند.

در تمام مراحل از کنترل منفی و مثبت برای تفسیر دقیق لام‏ها و اطمینان از صحت تکنیک رنگ‏آمیزی انجام شده، استفاده گردید. در کنترل منفی به جای آنتی‏بادی از سرم انسانی و در کنترل مثبت از نمونه‏هایی که به طور تیپیک مثبت می‏شوند، که برای NCAM روده کوچک انسان، برای S-100 شوانوما، برای GFAP اپاندیموما و برای PECAM-1 گلومانژیوما بود، استفاده شد.

در هر یک از تومورها ابتدا واکنش ایمنی برای سلول‏های مختلف بررسی شد. در تومورهای موکواپی‏درمویید کارسینوما، رنگ‏پذیری سلول‏های موکوسی، سلول‏های اسکواموس و سلول‏های حد واسط و در تومورهای آدنویید سیستیک کارسینوما، رنگ‏پذیری سلول‏های داکتال وسلول‏های میواپی‏تلیال بررسی شد.

همچنین واکنش ایمنی نمونه‏ها بر اساس روش معرفی شده توسط رگزی، گروه (Score) بندی گردید.(20و3)

صفرß بدون واکنش

1+ ß رنگ‏پذیری پراکنده و کانونی

2+ ß حداکثر 25 درصد سلول‏ها مثبت

3+ ß بین 50-25 درصد سلول‏ها مثبت

4+ ß بیشتر از 50 درصد سلول‏ها مثبت

سپس اطلاعات بدست آمده با استفاده از آزمون‏های آماری مان ویتنی و دقیق فیشر تحلیل آماری شدند.

شدت رنگ‏پذیری سلول‏ها، تراکم یا شدت بروز مارکر در هر سلول می‏باشد که به طور متوسط در یک فیلد میکروسکوپیک بر اساس تجربه آسیب‏شناس مورد ارزیابی قرار گرفت، به این صورت که اگر با بزرگنمایی کم، رنگ‏پذیری سلول‏ها مشهود بود، بیشترین شدت تشخیص داده شد.

یافته‏ها

 در نمونه‏های بررسی شده در H&E، از 20 مورد AdCC، در 7 مورد (35%) طرح غربالی یا Cribriform، در 7 مورد (35%) طرح توبولارترابکولار و در 6 مورد (30%) طرح توپر یا  Solidغالب بود و از 20 مورد MEC 7 مورد (35%) درجه کم، 6  مورد (30%) درجه متوسط و 7 مورد (35%) درجه بالا تشخیص داده شدند.

پس از مشاهده و بررسی نمونه‏ها از نظر رنگ‏پذیری برای آنتی‏بادی‏های به کار گرفته شده (GFAP، NCAM، S-100، PECAM-1) مشخص شد که در تمام نمونه‏های آدنوییدسیستیک کارسینوما، سلول‏های تومورال با S-100 واکنش مثبت نشان داده که میزان رنگ‏پذیری بین 1+ تا 4+ متغیر بود (یک مورد 1+، 8 مورد 2+، 5 مورد 3+ و 6 مورد 4+). همچنین شدت رنگ‏پذیری سلول‏های تومورال در واکنش با آنتی‏بادی S-100 نیز بین 2+ تا 4+ متغیر بود (سه مورد 2+، 5 مورد 3-2+، 2 مورد 3+، 6 مورد 4-3+ و 4 مورد 4+). در مورد GFAP میزان رنگ‏پذیری و شدت آن بین 0 تا 1+ متغیر بود (18 مورد منفی و 2 مورد 1+). در تمام نمونه‏های مربوط به موکواپی‏درمویید کارسینوما، سلول‏های تومورال با S-100 واکنش مثبت نشان داده که میزان رنگ‏پذیری بین 1+ تا 4+ متغیر بود (9 مورد 1+، 5 مورد 2+، 5 مورد3 + و 1 مورد 4+). همچنین شدت رنگ‏پذیری سلول‏های تومورال در واکنش با پروتئین
S-100 بین 1+ تا 4+ متغیر بود (3 مورد 1+، 4 مورد 2+، 7 مورد 3-2+، 4 مورد 3+ و 2 مورد 4+). در مورد GFAP میزان رنگ‏پذیری و شدت رنگ‏پذیری سلول‏های تومورال بین 0 تا 1+ متغیر بود (11 مورد منفی و 9 مورد 1+).

در تمام نمونه‏های موکواپی‏درمویید  کارسینوما و آدنوییدسیستیک کارسینوما، سلول‏های تومورال با NCAM و PECAM-1 واکنش نشان ندادند.

در رابطه با مقایسه فراوانی پروتئین S-100، نتایج این تحقیق نشان داد که فراوانی نسبی پروتئین S-100 در تومورهای موکواپی‏درمویید کارسینوما و آدنوییدسیستیک کارسینومای غدد بزاقی متفاوت است و با استفاده از آزمون آماری Mann-Whitney تفاوت معنی‏داری مشاهده شد (007/0=P)،(693/2-=Z)،(2=Median) (جدول1).

در رابطه با مقایسه شدت رنگ‏پذیری پروتئین S-100، نتایج این تحقیق نشان داد که شدت رنگ‏پذیری پروتئین S-100 در تومورهای آدنوییدسیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید کارسینومای غدد بزاقی متفاوت است و با استفاده از آزمون آماری Mann-Whitney تفاوت معنی‏داری مشاهده شد (010/0=P)، (308/2-=Z)، (5/2=Median) (جدول 2) (تصاویر 1و2).

در رابطه با فراوانی و شدت رنگ‏پذیری پروتئین GFAP، نتایج این مطالعه نشان داد که تظاهر این پروتئین در تـومـورهـای آدنوییدسیسـتیـک کـارسـینومـا و موکواپی‏درمویید کارسینومای غدد بزاقی متفاوت است و این تفاوت از نظر آماری معنی‏دار بود. با توجه به اینکه در مورد این مارکر فقط دو حالت صفر و یک وجود دارد از آزمون آماری دقیق فیشر که با 013/0=P معنی‏دار گردید استفاده شده است (448/2-=Z)، (0=Median)(جدول 3).

بطور کلی، درجات هیستولوژیک متفاوت MEC و طرح‏های هیستولوژیک مختلف AdCC، تفاوتی از نظر رنگ‏آمیزی IHC برای مارکرهای S-100 و GFAP نشان ندادند.

در مورد پروتیئن‏های NCAMو  PECAM-1هیچ یک از سلول‏های تومورال در دو تومور تحت بررسی، واکنش مثبت به این پروتئین‏ها نشان نداده و با استفاده از آزمون آماری Mann-Whitney تفاوت معنی‏داری مشاهده نشد
(1=
P) (تصاویر 3و4).

 

 

 

 

 

 

 

 

بزرگنمایی (100×)

 

بزرگنمایی (400×)

تصویر 1 : رنگ‏آمیزی S-100 در آدنویید سیستیک کارسینوما واکنش مثبت برای S-100 در سلول‏های تومورال قابل مشاهده است.

 

 

بزرگنمایی (100×)

 

بزرگنمایی (400×)

تصویر 2 : رنگ‏آمیزی S-100 در موکواپیدرموئید کارسینوما واکنش مثبت برای S-100 در سلول‏های تومورال قابل مشاهده است.

 

 

MEC بزرگنمایی (400×)

 

AdCC بزرگنمایی (400×)

تصویر 3 : رنگ‏آمیزی منفی PECAM-1 در آدنوییدسیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید کارسینوما

 

 

MEC بزرگنمایی (100×)

 

AdCC بزرگنمایی (400×)

تصویر 4 : رنگ‏آمیزی منفی NCAM در آدنوییدسیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید کارسینوما

 

جدول 1 : توزیع فراوانی نمونه‏ها به تفکیک میزان رنگ‏پذیری پروتئینS-100

نوع تومور

میزان رنگ‏پذیری پروتئین S-100

کل

1+

2+

3 +

4+

آدنوییدسیستیک کارسینوما

1 (5%)

8 (40%)

5(25%)

6(30%)

20(100%)

موکواپی‏درمویید  کارسینوما

9(45%)

5(25%)

5(25%)

1(5%)

20(100%)

007/0Mann-Whitney: P-value=

 

 

 

جدول 2 : توزیع فراوانی نمونه‏ها به تفکیک شدت رنگ‏پذیری پروتئینS-100

نوع تومور

شدت رنگ‏پذیری پروتئین S-100

کل

1+

2+

3+ تا 2+

3+

4+ تا 3+

4+

آدنوییدسیستیک کارسینوما

صفر

3(15%)

5(25%)

2(10%)

6(30%)

4(20%)

20(100%)

موکواپی‏درمویید  کارسینوما

3(15%)

4(20%)

7(35%)

4(20%)

2(10%)

صفر

20(100%)

01/0Mann-Whitney: P-value=

 

 

 

جدول 3 : توزیع فراوانی نمونه‏ها به تفکیک میزان و شدت رنگ‏پذیری پروتئینGFAP

نوع تومور

میزان و شدت رنگ‏پذیری پروتئین GFAP

کل

صفر

1+

آدنوییدسیستیک کارسینوما

18(90%)

2(10%)

20(100%)

موکواپی‏درمویید  کارسینوما

11(55%)

9(45%)

20(100%)

013/0Fisher's Exact test: P-value=

 

 

 

 


بحث

روند بیولوژیک تومورها نقش مهمی در تعیین پیش‏آگهی و حتی طرح درمان آنها دارد. از جمله عوامل دخیل در روند بیولوژیک تومورها، محل ایجاد تومور، اندازه تومور، حضور تومور در خط برش جراحی یا به عبارت دیگر جراحی ناکافی و عاری از حاشیه سالم، سن، جنس، خصوصیات هیستوپاتولوژیک، تهاجم عصبی و عروقی آنها می‏باشد، که البتّه این عوامل می‏تواند همگی روی یکدیگر تأثیر گذاشته و هیچ یک از آنها عامل کاملاً مستقلی نمی‏باشد.(22و21) در مطالعه حاضر با استفاده از روش ایمونوهیستوشیمی در مورد تهاجم عصبی و عروقی موکواپی‏درمویید کارسینوما و آدنوییدسیستیک کارسینوما که از شایع‏ترین تومورهای بدخیم غدد بزاقی می‏باشند بحث شده است. از آن جایی که روند بیولوژیک این دو تومور متفاوت تلقی شده و تهاجم عصبی بیشتر در مورد آدنوییدسیستیک کارسینوما ذکر شده است،احتمال تمایز سلول‏های میواپی­تلیال به سلول‏های عصبی در این تومور مطرح بوده که ممکن است از طریق اتصال هموفیلیک به سلول‏های شوان غلاف عصبی در تهاجم عصبی نقش داشته باشند.(15و14)

اگرچه در آدنویید سیستیک کارسینوما احتمال تمایز سلول‏های میواپی‏تلیال به سلول‏های عصبی و نقش آن در تهاجم عصبی مطرح شده است ولیکن در مطالعه‏ای که Vural و Mclaughlin بر روی تظاهر NCAM در SCC سرو گردن انجام دادند، نتیجه گیری شد که بروز NCAM توسط سلول‏های تومورال ممکن است هم، چسبندگی هموفیلیک سلول به سلول و هم چسبندگی هتروفیلیک سلول به ماده زمینه را تسهیل نماید و بدینوسیله در تهاجم عصبی مؤثر باشد.(8و7) از آنجایی که SCC فقط حاوی سلول‏های اپی‏درموئید بوده و فاقد سلول میواپی‏تلیال می‏باشد، این احتمال مطرح می‏گردد که وجود سلول میواپی‏تلیال برای تهاجم عصبی الزامی نیست و سلول‏های تومورال بدخیم دیگر با منشأ غیر از غدد بزاقی ممکن است از طریق اتصال هموفیلیک در تهاجم عصبی نقش داشته باشند. بر این اساس می‏توان چنین استنتاج نمود که احتمالاً با عدم تمایز بیشتر سلول‏های بدخیم در یک کارسینوم با منشاء غیر از غدد بزاقی، شباهت مورفولوژیک این سلول‏ها با سلول‏های شوان غلاف عصبی بیشتر شده و از طریق اتصال هموفیلیک به این سلول‏ها احتمالاً تهاجم عصبی تسهیل می‏گردد.

همانطور که Vural و همکارانش نیز مطرح نموده‏اند، تهاجم عصبی در SCC می تواند یک عامل پیش‏گویی‏کننده ضعیف در ارتباط با افزایش خطر عود موضعی، متاستاز عقده‏های لنفاوی و کاهش بقای بیماران تلقی گردد.(8) در تایید فرضیه فوق در مورد تهاجم عصبی تومورهای غیر غدد بزاقی، Thurairaja و همکارانش نیز نتایج مشابهی با تومورهای پروستات به دست آوردند. آنها براساس یافته‏های خود تهاجم اطراف عصبی را مرتبط با متاستازهای استخوانی و پیش‏آگهی ضعیف‏تر تومور ارزیابی کردند و این خصوصیت را یک عامل پیش‏گویی‏کننده مهم برای متاستاز اولیه استخوانی در تومور پروستات تلقی نمودند. نکته جالب در بررسی آنها، عدم ارتباط تهاجم عروقی با متاستازهای استخوانی بود که این یافته نشان‏دهنده پیش‏آگهی ضعیف‏تر تهاجم عصبی در مقایسه با تهاجم عروقی در کارسینوماهای غیر غدد بزاقی می‏باشد.(11)

در اینجا این سئوال مطرح می‏گردد که آیا همانند SCC می‏توان از بروز NCAM به عنوان یک عامل پیش‏گویی‏کننده در تهاجم عصبی و پیش‏آگهی یک تومور بدخیم غده بزاقی مثل آدنویید سیستیک کارسینوما استفاده نمود. پژوهشگرانی چون Hutcheson و همکارانش که بر روی تظاهر NCAM در آدنویید سیستیک کارسینوما و ارتباط آن با گسترش اطراف عصبی بررسی مشابهی روی 37 مورد آدنویید سیستیک کارسینوما انجام دادند، در 25 (68%) مورد شواهد هیستوپاتولوژیک تهاجم اطراف عصبی را مشاهده کردند در صورتی که در همه 37 مورد، بروز NCAM را بدون توجّه به وجود تهاجم اطراف عصب مشاهده نمودند. بنابراین استنتاج کردند که بروز مارکر NCAM به تنهایی دال بر تهاجم عصبی نمی باشد و استفاده از آن به عنوان یک عامل پیشگویی کننده برای تهاجم اطراف عصبی در آدنویید سیستیک کارسینوما بسیار غیرمحتمل است.(9)

در بررسی Perschbacher و همکارانش نیز که در سال 2004 بر روی غدد بزاقی طبیعی و تعدادی از بدخیمی‏های غدد بزاقی انجام گرفت، واکنش مثبت به NCAM در تعدادی از نمونه‏های آدنویید سیستیک کارسینوما مشاهده شد ولی با توجه به اینکه هیچ کدام از سلول‏های تومورال دارای واکنش مثبت، در مجاورت با اعصاب نبودند، چنین استنتاج گردید که حضور NCAM ارتباطی با تهاجم اطراف عصبی ندارد. بنابراین در صورتی می‏توان از نتایج مثبت به دست آمده در مورد NCAM، تهاجم عصبی را استنباط کرد که سلول‏های دارای واکنش مثبت به این مارکر، مجاور عصب باشند. پس با توجه به این مطالعه می‏توان نتیجه گیری نمود که بروز NCAM هیچ ارتباطی با حضور هیستولوژیک تهاجم عصبی یا رفتار بیولوژیک تومور غده بزاقی مانند آدنویید سیستیک کارسینوما ندارد.(4)

 به علاوه در صورتی که رفتار تهاجم اطراف عصبی در آدنویید سیستیک کارسینوما یا احیاناً تومورهای دیگر غدد بزاقی را به سلول میواپی‏تلیال منسوب نماییم، از آنجایی که سلول میواپی‏تلیال سلول مختلف الشکلی بوده که به اشکال مختلف در تومورهای غدد بزاقی بروز می‏کند، تمایز سلول شوان در آن الزاماً دال بر عدم تمایز سلولی نیست و نمی توان تهاجم اطراف عصبی در تومور آدنویید سیستیک کارسینوما یا تومورهای دیگر غدد بزاقی را الزاماً نمایانگر پیش‏آگهی ضعیف‏تر این تومورها دانست. کما اینکه در بررسی Vanderwal و همکاران در سال 1990 نیز هیچ ارتباط مهمی از نظر آماری بین تهاجم اطراف عصبی و متاستاز دوردست در 22 مورد آدنویید سیستیک کارسینومای داخل دهانی که ابتدائاً به وسیله جراحی با یا بدون رادیوتراپی بعد از عمل درمان شده بودند، یافت نشد. همچنین هیچ ارتباطی بین گسترش اطراف عصبی و محل اولیه یا اندازه تومور وجود نداشت. اگرچه تهاجم اطراف عصبی بیشتر در تومورهایی که گسترش موضعی داشتند و در مواردی که حواشی جراحی، شواهد مثبت از تومور را نشان می‏دادند، رخ داده بود.(10) نکته قابل ذکر آن است که حتی در تومورهای خوش‏خیم بزاقی مثل بازال سل آدنوما نیز پیشروی یا تجاوز اطراف عصبی توصیف شده که الزاماً دال بر بدخیمی نمی باشد.(23)

با این حال به علت مورفولوژی و یافته‏های ایمونولوژی متغیر در تومورهای غدد بزاقی از جمله آدنوییدسیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید  کارسینوما هنوز سوالات زیادی بدون پاسخ مانده است.

براساس یافته‏های بدست آمده در بررسی ما، GFAP کمتر از S-100 برای افتراق AdCC و MEC قابل استفاده بود. اگرچه با توجه به اینکه مارکر NCAM در هر دو تومور کاملا منفی بود، نمی توانستیم از یافته‏های بدست آمده چنین استنتاج کنیم که تهاجم اطراف عصبی در AdCC بیشتر از MEC روی می‏دهد. در مورد تهاجم عروقی نیز با توجه به اینکه مارکر PECAM-1 در هر دو تومور کاملاً منفی بود، نمی توانستیم استنتاج کنیم که تهاجم عروقی این دو تومور متفاوت می‏باشد.

مانند مطالعه Toth و همکارانش در مطالعه ما نیز واکنش مثبت به S-100 در آدنوییدسیستیک کارسینوما مشاهده شد. همینطور در مطالعه Toth تمام نمونه‏ها به GFAP واکنش مثبت نشان دادند که با نتایج به دست آمده در تحقیق ما مغایرت دارد. علت این تفاوت شاید به دلیل آن است که در مطالعه Toth از تکنیک‏های ایمونوهیستوشیمی متفاوت و رنگ‏آمیزی Solochrome که یک رنگ‏آمیزی اختصاصی میلین می‏باشد، استفاده شده است. علاوه بر اینکه احتمال خطاهای تشخیصی را نیز نمی‏توان منتفی دانست.(5)

نتایج مطالعه ما با نتایج تحقیقات انجام شده توسط Sun و Luo در مورد واکنش مثبت به S-100 در آدنوییدسیستیک کارسینوما یکسان است ولی در مورد مارکر  GFAP در آدنوییدسیستیک کارسینوما و همچنین عدم واکنش موکواپی‏درمویید کارسینوما با S-100 و GFAP مغایرت دارد. علت این تفاوت، احتمالاً به اختلاف تکنیک‏های بکار رفته و خطاهای تشخیصی مربوط است. اگرچه روش ایمونوهیستوشیمی آنها نسبت به بررسی حاضر که از NPDBS استفاده شده، از دقت و حساسیت کمتری برخوردار می‏باشد ولیکن چون علاوه بر آن از ایمونوفلوئوروسانس دوگانه و CLSM که تکنیک‏های پیشرفته‏تری هستند، استفاده شده، لذا نتایج پژوهش آنها احتمالاً از دقت بالاتری برخوردار می‏باشند.(15و14)

همچنین نتایج تحقیق ما با مطالعه دیهیمی و ترابی‏‎نیا در سال 2004 مغایرت دارد که در مطالعه آنها هیچ یک از نمونه‏های MEC با GFAP و S-100 واکنش نشان ندادند. علّت تفاوت در نتایج احتمالاً به اختلاف تکنیک بکار رفته مربوط می‏باشد که تکنیک استفاده شده در بررسی دیهیمی و ترابی‏نیا روش معمول Biotin-streptavidin بوده که نسبت به تکنیک بکار رفته در مطالعه ما از دقت و حساسیت کمتری برخوردار است.(24)

بعلاوه نتایج بررسی ما با تحقیقات انجام شده توسط Gandour-Edwards و Shang در مورد حضور پروتئین NCAM در آدنوییدسیستیک کارسینوما مغایرت دارد.(16و6) علت این تفاوت مشخص نیست، شاید اختلاف تفسیر پاتولوژیک یا ضعف تکنیک، موثر باشد. از آنجایی که تمامی مارکرهای بکار رفته در بررسی حاضر دارای میل ترکیبی بالایی بوده لذا در صورت وجود آنتی‏ژن در بافت قطعاً با آن واکنش نشان می‏دادند. بنابراین منفی بودن نتایج به احتمال زیاد ناشی از عدم وجود آنتی‏ژن در بافت می‏باشد. همینطور ممـکن است منفی بودن نتایج به دلیل قدیمـی بودن بلوک‏های پارافینـی باشد که آنتی‏ژن‏های آن ردیابی نشده است ولی با توجه به این که در مطالعه ما بلوک‏های پارافینی جدیدتر نیز هیچ واکنشی نشان نداده‏اند این احتمال کمتر مطرح می‏باشد. دلیل دیگر برای عدم بروز NCAM و PECAM-1 در بررسی ما می‏تواند شدت بروز کم این دو مارکر باشد زیرا مارکرهای دیگر با شدت بروز بیشتر (S-100) با بلوک‏های پارافینی قدیمی یا فیکساتیوهای معمول، واکنش نشان داده اند. همچنین این امکان وجود دارد که در زمان تهیه بلوک‏ها از روش غیراستاندارد مانند الکل با کیفیت پایین، افزایش درجه حرارت پارافین و فیکساسیون نامناسب استفاده شده که به همین دلیل آنتی‏ژن‏های آن قابل شناسایی نمی‏باشند.

نتایج بررسی ما با تحقیقات انجام شده توسط Franca و همکاران نیز در مورد حضور پروتئین NCAM در آدنوییدسیستیک کارسینوما مغایرت دارد. همانطور که ذکر شد در مطالعه Franca از روش ایمونوهیستوشیمی Strepto-avidin-biotin، محیط کشت و میکروسکوپ ایمونوفلورسانس استفاده شده بود، اگر چه روش ایمونوهیستوشیمی آنها در مقایسه با مطالعه ما از دقت و حساسیت کمتری برخوردار می‏باشد امّا چون از محیط کشت و میکروسکوپ ایمونوفلورسانس استفاده شده لذا احتمالاً نتایج آنها از دقت بالاتری برخوردار است.(12)

 نتایج مطالعه Perschbacher و همکاران در رابطه با بروز و توزیع NCAM و PECAM-1 در آدنوییدسیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید کارسینوما با نتایج بررسی ما مغایرت داشت، اگرچه در مطالعه آنها، PECAM-1 تنها در یک مورد آدنویید سیستیک کارسینوما و یک مورد موکواپی‏درمویید کارسینوما یافت شد که بالتبع ارزش آماری نیز ندارد. در مطالعه آنها از تکنیک بیوتین آویدین استفاده شده بود که نسبت به تکنیک به کار رفته در تحقیق ما از دقت و حساسیت کمتری برخوردار می‏باشد. ولی با توجّه به اینکه روش استفاده شده در مطالعه حاضر از دقت و حساسیت بالاتری برخوردار است قاعدتاً بایستی آنتی‏ژن‏های مورد نظر را بهتر ردیابی می‏کرد، بنابراین علت منفی شدن نتایج ما، ممکن است به علّت فیکساسیون بیش از حد بافت یا نامناسب بودن مواد ثبوت‏کننده باشد. به علاوه شدت بروز اندک این دو مارکر نیز می‏تواند دلیل دیگر منفی شدن نتایج ما باشد. همچنین در مطالعه آنها تعداد نمونه‏های موکواپی‏درمویید کارسینوما تنها 4 مورد بوده است که با این تعداد اندک امکان قضاوت صحیحی وجود ندارد.(4)

نتیجه گیری

1- در بررسی حاضر بروز پروتئین S-100 در تمام موارد آدنوییدسیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید  کارسینوما مشاهده گردید که فراوانی و شدت رنگ‏پذیری این پروتئین به طور معنی‏داری در آدنوییدسیستیک کارسینوما بیشتر بود. در مقابل فراوانی و شدت رنگ‏پذیری پروتئین GFAP تنها در مورد 1+ در موکواپی‏درمویید کارسینوما بیشتر از آدنویید سیستیک کارسینوما بود. لذا به عنوان یک مارکر برای افتراق تهاجم اطراف عصبی در این دو تومور کمتر از S-100 قابل استفاده بود.به عنوان یک یافته جنبی، با توجّه به واکنش مثبت S-100 و GFAP در آدنوییدسیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید کارسینوما احتمالاً سلول‏های میواپی‏تلیال در هیستوژنز این دو تومور نقش دارتد.

2- بروز مارکرهای NCAM و PECAM-1 در هیچکدام از تومورهای موکواپی‏درمویید کارسینوما و آدنویید سیستیک کارسینوما مشاهده نشد. لذا این دو مارکر برای افتراق تهاجم عصبی و عروقی بین تومورهای مزبور قابل استفاده نبود. با توجه به عدم بروز مارکرهای مزبور در تمام نمونه‏های مورد بررسی، احتمالاً شدت بروز این دو مارکر در تومورهای فوق حتی در صورت بروز، انـدک اسـت. لـذا کـاربـرد تکنیـک‏های دقیـق‏تـر ایمونوهیستوشیمی برای ردیابی آنها ضروری می‏باشد.

3- در بـررسی حاضـر با توجّه به یافـته‏های به دسـت آمده از مارکـرهای فوق‏الذکر، به نظر نمی‏رسید تهاجم اطراف عصبی و عروقی تومور آدنویید سیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید کارسینوما تفاوت معنی‏داری داشته باشد.

4- درجه‏های هیستولوژیک متفاوت موکواپی‏درمویید  کارسینوما و طرح‏های هیستولوژیک مختلف آدنوییدسیستیک کارسینوما تفاوتی از نظر رنگ‏آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای مارکرهای S-100 و GFAP نشان ندادند. بنابراین نمی‏توان از مارکرهای فوق الذکر برای مقایسه تهاجم اطراف عصبی درجه‏های مختلف هیستولوژیک موکواپی‏درمویید کارسینوما و طرح‏های هیستولوژیک متفاوت آدنوییدسیستیک کارسینوما استفاده نمود.

5- در این بررسی با توجّه به فقدان بروز NCAM در آدنوییدسیستیک کارسینوما و موکواپی‏درمویید کارسینوما ارتباط این مارکر با تهاجم اطراف عصبی یا به طور کلی روند بیولوژیک این دو تومور مشخص نشد. البته همانطور که قبلاً ذکر شد، حتی با وجود مثبت شدن NCAM، در صورتی می‏توان تهاجم اطراف عصبی را استنباط نمود که سلول‏های دارای واکنش مثبت با این مارکر، مجاور عصب باشند.

6- در این بررسـی با توجـّه به فقـدان بـروز PECAM-1 در آدنوییدسیستیـک کارسـینوما و موکواپی‏درمویید کارسینوما ارتباط این مارکر با تهاجم عروقی یا به طور کلی روند بیولوژیک این دو تومور مشخص نشد.

7- در نتیجه گیری کلی، با توجه به اینکه رفتار تهاجم اطراف عصبی در تومورهای غدد بزاقی، به سلول میواپی‏تلیال که سلول مختلف‏الشکلی است، نسبت داده شده، نمی توان تهاجم اطراف عصبی در این تومورها را الزاماً نمایانگر پیش‏آگهی ضعیف‏تر آنها تلقی نمود ولی در تومورهای غیر غدد بزاقی که فاقد سلول‏های میواپی‏تلیال می‏باشند، چنین فرض می‏شود که تهاجم اطراف عصبی به عدم تمایز سلول‏های تومورال مربوط باشد و بنابراین احتمالاً با پیش‏آگهی ضعیف‏تر این تومورها همراه است. با این وجود، مکانیسم تهاجم اطراف عصبی در تومورهای غدد بزاقی و غیر غدد بزاقی یکسان به نظر می‏رسد و بیشتر از طریق اتصال هموفیلیک سلول‏های تومورال به سلول‏های شوان غلاف عصبی می‏باشد، البته در صورتی که سلول‏های تومورال دارای خصوصیات دیسپلاستیک باشند. لذا چنین خصوصیتی فقط در مورد تومورهای بدخیم صادق است، وگرنه در بعضی تومورهای خوش‏خیم بزاقی و غیر بزاقی نیز ممکن است مارکرهای عصبی مثبت باشند ولی تهاجم عصبی واقعی معمولاً روی نمی دهد، چون سلول‏ها فاقد خصوصیات دیسپلاستیک هستند.

 

پیشنهادات

1-توصیه می‏شود بررسی دقیق‏تری در مورد وقوع هم زمان مارکرهای عصبی مورد پژوهش در اعصاب و سلول‏های تومورال که در تماس با اعصاب هستند، انجام شود تا بتوان نتیجه گیری دقیق‏تری نمود.

2- توصیه می‏شود از تکنیک‏های ایمونوهیستوشیمی دقیق تر مانند Immunogold silver staining method و در صورت امکان میکروسکوپ ایمونوالکترونی، CLSM و ایمونوفلورسانس دوگانه برای بررسی تهاجم عصبی و عروقی استفاده شود.

3- توصیه می‏شود در صورت امکان از بلوک‏های پارافینی جدیدتر استفاده شودونیزدر زمان تهیه بلوک‏ها، روش‏های استاندارد کاملاً اجرا شده و در صورت امکان از فیکساتیو fine-fix استفاده شود.

4- توصیه می‏شود از سایر مارکرهای عصبی مانند (NGF)Nerve Growth Factor و تیروزین کیناز Aبرای بررسی تهاجم اطراف عصبی و نیز سایر مارکرهای عروقی مانند Vascular endothelial growth factor (VEGF)و Factor VIII برای بررسی تهاجم عروقی این تومورها استفاده شود. به علاوه، پیشنهاد می‏گردد بر روی نقش پروتئین‏های غشاء پایه در تظاهر مارکرهای ایمونوهیستوشیمی و استفاده از محیط کشت برای بررسی تهاجم اطراف عصبی و عروقی در تومورهای غدد بزاقی تحقیقات بیشتری صورت گیرد.

5- توصیه می‏شود مطالعات مولکولی و ژنتیکی در رابطه با ژن‏های مرتبط با تهاجم عصبی و عروقی تومورهای غدد بزاقی به خصوص تومورهای مورد مطالعه، انجام شود.

تشکر و قدردانی

در پـایان لازم می‏باشـد که از زحـمات سرکار خـانم

فرزانه محمودی کارشناس آزمایشگاه آسیب شناسی دهان دانشکده دندانپزشکی اصفهان و نیز معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان که پشتیبانی مالی طرح تحقیقاتی را بر عهده داشتند، قدردانی و سپاسگزاری گردد.



[1]. (CD54) ICAM یک مولکول چسبنده بین سلولی است که روی سلول های اندوتلیالی یا سلول های اپی تلیالی دیگر یافت می شود وافزایش یا انحراف بروز آن،تهاجم عروقی را تسهیل می نماید.

[2].  HCAM(CD44) روی سلول های شوان و سلول های اپی تلیالی دیگر نمایان می شود که افزایش بروز یا انحراف بروز آن،تهاجم اطراف عصبی را تسهیل می‏نماید.

  1. Rosai J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. 9th ed. St. Louis: Mosby Co; 2004. P. 7-20, 37-73.
  2. Campbell JB, Crocker J, Shenoi PM. S-100 protein localization in minor salivary gland tumors: An aid to diagnosis. J Laryngol Otol 1988; 102(10): 905-8.
  3. Curran AE, White DK, Damm DD, Murrah VA. Polymorphous low-grade adenocarcinoma versus pleomorphic adenoma of minor salivary glands: Resolution of a diagnostic dilemma by immunohistochemical analysis with glial fibrillary acidic protein. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radio Endod 2001; 91(2): 194-9.
  4. Perschbacher K, Jackson-Boeters L, Daley T. The adhesion molecules NCAM, HCAM, PECAM-1 and ICAM-1 in normal salivary gland tissues and salivary gland malignancies. J Oral Pathol Med 2004; 33(4): 230-6.
  5. Toth AA, Daley TD, Lampe HB, Stitt L, Veinot L. Schwann cell differentiation of modified myoepithelial cells within adenoid cystic carcinomas and polymorphous low-grade adenocarcinomas: Clinicopathologic assessment of immunohistochemical staining. J Otolaryngol 1996; 25(2): 94-102.
  6. Gandour –Edwards R, Kapadia SB, Barnes L, Donald PJ, Janecka IP. Neural cell adhesion molecule in adenoid cystic carcinoma invading the skull base. Otolaryngol Head Neck Surg 1997; 117(5): 453-8.
  7. McLaughlin RB Jr, Montone KT, Wall SJ, Chalian AA, Weinstein GS, Roberts SA, et al. Nerve cell adhesion molecule expression in squamous cell carcinoma of the head and neck: A predictor of propensity toward perineural spread. Laryngoscope 1999; 109(5): 821-6.
  8. Vural E, Hutcheson J, Korourian S, Kechelava S, Hanna E. Correlation of neural cell adhesion molecules with perineural spread of squamous cell carcinoma of the head and neck. Otolaryngol Head Neck Surg 2000; 122(5): 717-20.
  9. Hutcheson JA, Vural E, Korourian S, Hanna E. Neural cell adhesion molecule expression in adenoid cystic carcinoma of the head and neck. Laryngoscope 2000; 110(6): 946-8.
  10. Van der Wal JE, Snow GB, van der Waal I. Intraoral adenoid cystic carcinoma. The presence of perineural spread in relation to site, size, local extension and metastatic spread in 22 cases. Cancer1990; 66(9): 2031-3.
  11. Thurairaja R, Macfarlane J, Iles R, Persad R, Bahl A. Does perineural invasion result in early bone metastases in prostate cancer. Proceedings of the prosthate cancer symposium; 2006 feb 24-26; USA; Sanfrancisco: 159.
  12. Franca CM, Jaeger MM, Jaeger RG, Araujo NS.The role of basement membrane proteins on the expression of neural cell adhesion molecule (NCAM) in an adenoid cystic carcinoma cell line. Oral Oncol 2000; 36(2):
    248-52.
  13. Kowalski PJ, Paulino AF. Perineural invasion in adenoid cystic carcinoma: It's causation / promotion by brain-derived neurotrophic factor. Hum Pathol 2002; 33(9): 933-6.
  14. Sun MY, Chen W, Yang LJ, Dong SZ. Coexpression of Schwann cell marker GFAP and myoepithelial cell marker alpha-SMA in salivary adenoid cystic carcinoma. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi 2006; 41(8): 461-3.
  15. Luo XL, Sun MY, Lu CT, Zhou ZH. The role of Schwann cell differentiation in perineural invasion of adenoid cystic and mucoepidermoid carcinoma of the salivary glands. Int J Oral Maxillofac Surg 2006; 35(8): 733-9.
  16. Shang J , Sheng L , Wang K, Shui Y, Wei Q. Expression of neural cell adhesion molecule in salivary adenoid cystic carcinoma and its correlation with perineural invasion. Oncol Rep 2007; 18(6): 1413-6.
  17. Neville B, Damm DD, Allen CM, Bouquot J. Oral and Maxillofacial Pathology. 3rd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2008. P. 453-507.
  18. Jordan RC, Daniels TE, Greenspan JS, Regezi JA.Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial pathology. Part II: Immunohistochemical and immunofluorescent methods. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2002; 93(1): 56-74.
  19. Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry. 1st ed. New York: Churchill Livingstone; 2002. P. 3-43.
  20. Regezi JA, Zarbo RJ, Batsakis JG. Immunoprofile of mucoepidermoid carcinomas of minor salivary glands. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1991; 71(2): 189-92.
  21. Regezi JA, Sciubba JJ, Jordan RCK. Oral Pathology: Clinical Pathologic Correlations. 5th ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2008. P. 179-215.
  22. Kumar V, Fausto N, Abbas A. Robbins & Cotrain Pathologic Basis of Disease. 7th ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2004. P. 309-13.
  23. Gnepp DR. Diagnostic Surgical Pathology of the Head and Neck: Expert Consult. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2009. P. 471-6, 482-6.
  24. Deyhimi P, Mahzooni P, Torabinia N. Study of myoepithelial cell markers in pleomorphic adenoma and mucoepidermoid carcinoma of salivary glands. Dental Researc Journal 2006; 3(2): 92-9.