تأثیر عملیات اسیدی دو مرحله‌ای بر رفتار سطح و بهبود زیست فعالی آلیاژ نایتینول

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشیار گروه مهندسی مواد، دانشکده مهندسی مواد و متالورژی، دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

2 دانشجوی دکتری مهندسی مواد، دانشکده مهندسی مواد و متالورژی، دانشگاه سمنان، سمنان، ایران

چکیده

مقدمه: ویژگی‌های سطح شامل ریخت‌شناسی، ریخت‌شناسی زیر میکرون و شیمی سطح از عوامل مهمی هستند که کیفیت و نحوه پاسخ‌های بیولوژیکی در محل تماس بافت با ماده کاشتنی را تحت تأثیر قرار داده و این موضوع می‌تواند بر روی فرآیند التیام استخوان تاثیر گذار واقع شود.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه آزمایشگاهی، ریخت‌شناسی و زیست‌سازگاری سطوح آلیاژ حافظه‌دار نایتینول صیقل‌کاری مکانیکی شده و اصلاح‌ شده با محلول شیمیایی متشکل از سه نوع اسید (HCl-HF-H3PO4) و سپس عملیات شیمیایی در محلول (HNO3 و HCl) با نسبت حجمی 1:1 و در درجه حرارت محیطبررسی شده است. تعداد 75 نمونه جهت اصلاح شیمیایی سطح، ارزیابی‌های بیولوژیکی و زبری سطوح و همچنین 9 نمونه به عنوان شاهد استفاده گردید. به منظور تحلیل و بررسی سطوح، ارزیابی‌های میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) و زبری‌سنجی از سطوح آلیاژ نایتینول (NiTi) به‌عمل آمد. به‌علاوه، سلول MG-63 بر روی سطوح مختلف آلیاژ نایتینول برای ارزیابی چسبندگی و رشد و تکثیر سلولی کشت گردید. داده‌ها با استفاده از تست‌های آماری t-test و آنالیز واریانس یک طرفه، آنالیز گردید.
یافته‌ها: نتایج بدست آمده نشان می‌دهد که عملیات اصلاح شیمیایی سطح با محلول اسیدی دو مرحله‌ای، زبری بالاتری در مقایسه با سطوح اصلاح نشده و عملیات اصلاح شیمیایی سطح با محلول اسیدی تنها با محلول متشکل از (HCl-HF-H3PO4) داشته است. همچنین ارزیابی های کشت سلولی مشخص نمود که سطوح نایتینول اصلاح شده دو مرحله‌ای، میزان چسبندگی سلولی و رشد و تکثیر قابل ملاحظه‌ای در مقایسه با گروه‌های اصلاح شده با محلول اسیدی سه‌تایی و سطوح اصلاح نشده، نشان داده است. 
نتیجه‌گیری: روش اصلاح شیمیایی سطح در مورد آلیاژ نایتینول می‌تواند علاوه بر تغییر ریخت‌شناسی سطح و ایجاد زبری‌های در مقیاس زیرمیکرونی باعث تغییر شیمی سطح شود. این موضوع می‌تواند قابلیت پیوند بافت ایمپلنت را افزایش داده و از تأثیر سمی عنصر نیکل بکاهد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of the effect of Two-Step Acid Etching on the Surface Treatment and Improved Bioactivity of Nitinol

نویسندگان [English]

  • Mardali Yousefpour 1
  • Amir Zareidoost 2
1 Associate Professor of Materials Engineering, Faculty of Materials & Metallurgical Engineering, Semnan University, Semnan, Iran.
2 Ph.D Student in Materials Engineering, Faculty of Materials & Metallurgical Engineering, Semnan University, Semnan, Iran.
چکیده [English]

Introduction: Surface properties, including morphology, submicron and chemical morphology, are important factors affecting the quality and biological responses at the contact location of tissue with the implant material. This could significantly affect the healing process of bones.
Materials & Methods: In this laboratory study, morphology and biocompatibility of polished mechanical nitinol (NiTi) shape memory alloys surfaces treated with mixed solution of three acids (HCl-HF-H3PO4) were evaluated. In the next stage, further chemical treatment was conducted in solution of HNO3 and HCl with ratio of 1:1 Vol.% at room temperature and the results were assessed. Seventy-five samples were selected for chemical modification of the surface, biological evaluation and surface roughness; furthermore, nine samples were selected as control. Scanning the Electron Microscope (SEM), atomic force microscope (AFM) and inspection of Nitinol surface roughness (NiTi) were carried out to evaluate the surface. In addition, MG-63 cell was cultured on different nitinol surfaces to assess cell adhesion, growth and proliferation. Data analysis was performed using t-test and one-way ANOVA.
Results: The obtained results indicated that HNO3 and HCl treatment produced significantly higher roughness compared to (HCl-HF-H3PO4) treatment and untreated surfaces. Moreover, evaluation of cell culture revealed significantly higher amounts of cell adhesion, growth and proliferation in two-stage modified nitinol surfaces, compared to the groups modified with triple acid solution and unmodified surfaces.
Conclusion: According to the results, not only chemical surface modification of nitinol changed the surface morphology and created submicron roughness, but it also led to altered chemistry of the surface. This could increase bone-bonding ability in implant and decrease the toxic effects of nickel in the body.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Nitinol alloy
  • chemical surface modification
  • Cell culture
  • acid etching

مقدمه

آلیاژهای نایتینول با درصد اتمی برابر از نیکل و تیتانیم، به عنوان کاشتنی فلزی در ارتوپدی قابل کاربرد هستند؛ این موضوع به دلیل خواص فوق کشسانی و مقاومت به خوردگی آن­ها است.(3-1) با وجود استفاده کلینیکی رضایت­بخش از آلیاژهای نایتینول در بعضی شرایط، حضور نیکل بالا در آلیاژ برای زیست­سازگاری آن­ها بسیار نگران کننده است.(4-1) زیست فعالی در آلیاژهای نایتینول را می­توان با روش­های مختلفی مانند پاشش پلاسمایی، عملیات گرمابی، رسوب دادن به کمک پرتو یونی، روش سل-ژل و عملیات­ شیمیایی ساده برای آماده سازی سطح مانند استفاده از محلول­های قلیایی (هیدروکسید سدیم) و یا اصلاح شیمیایی سطح با محلول اسیدی و همچنین عملیات اکسیداسیون با محلول پراکسید هیدروژن (H2O2) ایجاد نمود.(18-10و4-1) عملیات قلیایی لایه تیتانات سدیم بر روی سطح تیتانیم تولید
می نماید؛(12-11و2-1) در حالی­که عملیات با پراکسید هیدروژن تشکیل لایه ژلی از تیتانیا بر روی سطح می دهد.(1) این موضوع در حالی است که هر دو لایه تیتانات سدیم و ژلی تیتانیا توانایی ایجاد رسوب آپاتیت شبه استخوانی در محیط آزمایشگاهی و کلینیکی بر روی خود را دارند و از این منظر، زیست فعال تلقی می شوند.(2و1)

همچنین عملیات قلیایی در زیست فعال نمودن سطح زیست­ مواد دیگر مانند تانتالیم نیز موثر پیشنهاد شده است. همچنین پیشنهاد شده است که اصلاح سطح تیتانیم با اچ اسیدی می­تواند تأثیر مثبت بر روی یکپارچگی کاشتنی­ها در استخوان داشته باشد.(9-7) در یک مطالعه، رفتار استخوان به سطح زیست ماده (که سطح آن ماشین کاری شده و سپس با استفاده از محلول
HCl-H2SO4 اصلاح شیمیایی سطح با محلول اسیدی شده است) نشان از افزایش قابلیت زیست سازگاری در کاشتنی دارد.(9) در این راستا، مطالعه قبلی نویسندگان مقاله که تأثیر محلول اسیدی سه­تایی (HCl-HF-H3PO4) بر روی سطح کاشتنی تیتانیم خالص تجارتی بوده است، نیز موید این مطلب هست.(7) اما در مورد آلیاژهای نایتینول در بعضی شرایط، حضور عنصر نیکل بالا در آلیاژ برای زیست سازگاری آن­ها مشکل ساز است.(2و1) عنصر نیکل در ایجاد رفتارهای آلرژیک و سمیت­های کلینیکی موثر است.(2) چندین پژوهشگر گزارش نموده­اند که اگر یون­های نیکل از سطح آلیاژ در تماس با سیال بیولوژیکی بدن آزاد شود این امر می­تواند مشکل جدی برای بافت اطراف ماده کاشتنی ایجاد نماید.(15و2) به­علاوه، گزارش شده است که اصلاح سطح آلیاژ با استفاده از عملیات شیمیایی سطح می­تواند از آزاد شدن عنصر نیکل به واسطه تشکیل یک لایه همگن و پایدار از اکسید­های تیتانیم جلوگیری نماید؛ که نتیجه حاصل در بهبود قابلیت زیست سازگاری ماده بسیار موثر است.(12و2) همچنین در یک مطالعه برای ایجاد خاصیت زیست فعالی در سطح، از اسیدکلریدریک و پراکسید هیدروژن استفاده گردیده است.(16) در نهایت سیر تحقیقاتی در این زمینه نشان می دهد که اهداف دنبال شده برای اصلاح و ارتقاء زیست­سازگاری سطح نایتینول است.(14-10) لذا، هدف از این پژوهش، بررسی رفتار سطح آلیاژ نایتینول در حضور محلول­های اسیدی قوی و به دنبال آن تأثیر این عملیات بر افزایش قابلیت زیست سازگاری سطح این آلیاژ است. به علاوه، در این تحقیق از یک ایده جدید برای حضور کلسیم در سطح آلیاژ که به عنوان یک روش تقلید زیستی نیز مطرح است، استفاده شده است.(11و8-6)

مواد و روش ها

روش به کار رفته در این تحقیق از نوع آزمایشگاهی بود. نمونه­های آلیاژ نایتینول) 5/50 درصد اتمی نیکل) به صورت دیسکی شکل با قطر mm 5 و ضخامت mm 1 به تعداد 75 نمونه برای اصلاح شیمیایی سطح، ارزیابی­های بیولوژیکی و زبری سطوح و همچنین 9 نمونه به عنوان شاهد انتخاب شدند. سپس سطح نمونه‌ها با استفاد از سنباده‌های با شماره‌های به ترتیب 280، 320، 500، 600 مورد عملیات صیقل­کاری مکانیکی قرار گرفتند.(6) پس از انجام عملیات صیقل­کاری مکانیکی برای حذف آلودگی‌های سطحی و بدست آوردن یک سطح تمیز برای انجام عملیات اصلاح سطح، نمونه­ها در یک محفظه اولتراسونیک شستشو داده شدند. در این راستا، نمونه‌های صیقل­کاری مکانیکی شده با 40 درصد حجمی هیدروکسید سدیم (NaOH) و 50 درصد حجمی اسید نیتریک (HNO3) در محفظه التراسونیکی (ATSmall, Iran) که دارای فرکانس 40 هرتز (توان 240 وات) و تایمر مکانیکی (گرمکن 200 وات) به مدت 15 دقیقه بود، شستشو داده شدند. سپس با تخلیه محلول شستشو، مجدداً نمونه‌ها با آب مقطر در محفظه اولتراسونیک شستشو داده شده و نهایتاً در درجه حرارت محیط در الکل اتانول 70 درصد حجمی نگهداری شدند.(7)

نمونه‌های آلیاژ حافظه­دار تمیز شده مطابق جدول 1، در محلول‌های اسیدی قرار گرفتند و عملیات اصلاح سطح به روش شیمیایی بر روی آن­ها انجام شد. لازم به ذکر است، انتخاب نوع اسید و شرایط محلول اسیدی به مطالعه قبلی نویسندگان مقاله در زمینه اصلاح سطوح زیست مواد بر می­گردد.(8-6)  

هر کدام از محلول‌های اسیدی فوق به حجم 10 سی‌سی در بشرهای پلاستیکی تهیه شدند و به مدت یک روز نگهداری گردیدند. سپس تعداد 9 عدد نمونه نایتینول برای هر کدام از عملیات­های اصلاح شیمیایی سطح انتخاب شدند و همچنین 9 نمونه به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. سپس نمونه­های نایتینول در هر کدام از محلول‌های اسیدی، به مدت زمان 10 دقیقه برای عملیات اصلاح شیمیایی سطح  و 20 ساعت برای عملیات شیمیایی (به همراه مقدار بسیار کم از نمک سدیم کلراید برای ایجاد ترکیبات کمپلکس و تسریع واکنش خوردگی در سطح آلیاژ حاوی نیکل) در درجه حرارت محیط قرار گرفتند. بعد از انجام عملیات شیمیایی سطح، نمونه‌ها از محلول‌های با غلظت مشخص خارج شده و بلافاصله با آب مقطر و بعد با استون در محفظه التراسونیک شستشو داده شدند و بعد با استفاده از خشک‌‌کن الکتریکی، سطح نمونه‌ها در هوای معمولی خشک شد و سپس نمونه‌ها در دسیکاتور قرار گرفتند تا بررسی‌های لازم بر روی سطح آنها، صورت گیرد.

به­منظور بررسی مورفولوژی سطح نمونه­ها، تحلیل میکروسکوپ الکترونی روبشی (Sem، VegaTescan) با ولتاژ 20 کیلوولت انجام گردید. به­علاوه، برای  بررسی ریخت­شناسی و زبری سنجی سطح، از میکروسکوپ نیروی اتمی (Auto Probe, Scientific Park Instruments, Usa, Afm)  استفاده شد. 

سلول استخوان‌ساز (MG-63) با استفاده از محیط کشت (DMEM, GIBCO, Scotland) و افزودن 10 درصد سرم جنین گوساله FCS, Seromed, Germany)) به همراه آنتی‌بیوتیک به میزان 100 پنی سیلین و  100 استرپتومایسین (Sigma, USA) تکثیر گردید تا سلول برای دو نوع ارزیابی بررسی چسبندگی و رشد و تکثیر سلولی آماده شود:(19و9)

به منظور ارزیابی میزان رشد و تکثیر سلولی از روش MTT استفاده گردید.(9) روش MTT معمولاً برای بررسی بقاء سلول‌ها به کار می‌رود که استفاده از نمک زرد رنگ تترازولیوم است که این نمک بوسیله سلول‌ها جذب و سبب تشکیل کریستال‌های بنفش رنگ نامحلول فرمازان می‌گردد. در واقع این روش، براساس فعالیت آنزیم میتوکندریال سلولی استوار است. براین اساس، برای بررسی میزان رشد و تکثیر سلول بر روی سطح نمونه‌های تیتانیم دو زمان 3 و 6 روز در نظر گرفته شد. به علاوه، از تعداد   104 بر روی سطح نمونه‌های نایتینول استفاده گردید. لذا، با توجه به تکرار آزمایش­ها تا 3 مرتبه و زمان‌های ذکر شده در بالا تعداد 6 پیلت 96 حفره‌ای انتخاب شد که در هر کدام از آن‌ها یک دسته از گروه‌های انتخابی A تا D قرار داشت. برای تهیه محلول MTT با غلظت  5،  mg50 از پودر MTT در mg10 از PBS، 15/0 مولار حل شد و هنگام استفاده در رنگ آمیزی 10 برابر با PBS رقیق گردید تا محلول   5/0 MTTبه دست آید.


 

 

جدول 1 : شرایط عملیات اصلاح شیمیایی سطح بر روی گروه­های آلیاژ حافظه­دار

عملیات شیمیایی

شرایط محلول اسیدی

نمونه

-

-

A(Control)

بدون عملیات شیمیایی

80 درصداسیدکلریدریک-10 درصد  اسیدفلوئوریدریک- 10 درصداسیدفسفریک (10 دقیقه، دمای محیط)

B

اسیدنیتریک 56 درصد، (20 ساعت، در دمای محیط)

80 درصداسیدکلریدریک-10 درصداسیدفلوئوریدریک- 10 درصداسیدفسفریک (10 دقیقه، دمای محیط)

C

بدون عملیات شیمیایی

80 درصداسیدکلریدریک-10 درصداسیدفلوئوریدریک- 10 درصداسیدفسفریک- 7/1 گرم کلسیم فلوراید (10 دقیقه، دمای محیط)

D

اسیدنیتریک 56 درصد+اسیدکلریدریک37 درصد به نسبت حجمی (1:1)، (20 ساعت، در دمای محیط)

80 درصداسیدکلریدریک-10 درصداسیدفلوئوریدریک- 10 درصداسیدفسفریک- 7/1 گرم کلسیم فلوراید (10 دقیقه، دمای محیط)

E

 


لازم به ذکر است که پس از تهیه PBS، محلول اتوکلاو گردید. پس از انکوباسیون سلول‌های MG-63 بر روی سطوح در فواصل زمانی 3 و 6 روز، پلیت­هایی که در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5 درصد دی اکسید کربن انکوبه شده بودند با محلول   5/0 MTT رنگ آمیزی شدند. پس از 3 تا 5 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتی‌گراد، مایع رویی سلول‌ها برداشته شد و به جای آن 200 میکرولیتر محلول ایزوپروپانال (Merck, Germany) به حفره‌های مربوطه اضافه شد. پلیت‌های مربوطه به مدت 10 الی 15 دقیقه روی شیکر قرار گرفت. سپس پلیت‌‌های مربوط توسط یک میکروتیتر ریدر در570  نانومتر قرائت شد.(8)

برای آزمون چسبندگی سلولی، روش تریپان بلو استفاده شد. در این روش، غشاء سلول‌های زنده اجازه ورود رنگ‌های غیر الکترولیت را به درون سلول نمی‌دهند، اما سلول‌های مرده به خوبی رنگ می‌گیرند. با افزودن محلول تریپان بلو به PBS 15/0 مولار و سپس قرار دادن بر روی سطوح کشت داده شده درون چاهک­های پلیت، سلول‌های مرده رنگ گرفته و از سلول‌های زنده (بی‌رنگ) قابل تمایز هستند. سپس با کمک یک هیستومتر (لام نئوبار) تعداد سلول‌های رنگ گرفته (مرده) و تعداد سلول‌های زنده ( بدون رنگ) تعیین می­شوند.(8) به منظور آزمون چسبندگی سلول، تعداد 6000 سلول بر روی سطح هر نمونه قرار گرفت (به منظور رسیدن به مقدار مورد نظر برای کشت ظرف کشت در انکوباتور قرار داده شد) و به مدت 16 ساعت بر روی سطح نمونه‌های نایتینول کشت داده شد.

برای تحلیل نتایج حاصل از زبری سطح و ارزیابی­های زیستی از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون توکی استفاده شد. سطح معنی­داری در آزمون­ها 05/0 در نظر گرفته شد­.

یافته ها

در شکل 1، تصویر میکروسکوپ الکترونی از سطح نایتینول صیقل­کاری مکانیکی شده، آمده است. با بررسی این شکل، مشاهده می‌شود که سطح دارای خطوط شیاردار و موازی است. (شکل a-1). وقتی‌که، سطح آلیاژ حافظه­دار صیقل­کاری مکانیکی شده، در محلول 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک به مدت 10 دقیقه و در درجه حرارت محیط قرار می‌گیرد، این محلول اسیدی تأثیر چندانی در ایجاد و بروز تخلخل‌های سطحی بر روی آلیاژ ندارد (شکل b-1). همچنین در تصویر، شیارهایی ناشی از صیقل­کاری مکانیکی و کندگی‌های سطحی ناشی از خورندگی اسید به چشم می‌خورد. لذا، این محلول اسیدی با شرایط ذکر شده در بالا، قابلیت ایجاد حفرات با ابعاد میکرون را بر روی سطح نمی‌تواند داشته باشد. شکل (c-1)، سطح آلیاژ حافظه­دار را پس از قرار گرفتن در محلول مربوط به گروه C نشان می­دهد. همچنین حفرات ایجاد شده، تقریباً به شکل منظم بوده و از شکل هندسی کروی (تخلخل­های کروی شکل) پیروی می‌کنند. نتایج مربوط به قرارگرفتن نایتینول در محلول اسیدی سه­تائی به همراه عامل ایجاد کننده گروه­های زیستی بر روی سطح (کلسیم فلوراید)، در شکل (d-1) آمده است که حفرات سطحی با اندازه کوچکتر نسبت به عملیات شیمیایی با اسیدنیتریک را نشان می­دهد. به­علاوه، در بعضی از نواحی، سطح تحت تأثیر محلول اسیدی قرار نگرفته است. در نتیجه، بافت سطحی مرجع ایجاد نشده است. شکل (e-1)، عملیات اصلاح سطح آلیاژ نایتینول را تحت شرایط 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک، 7/1 گرم کلسیم فلوراید (10 دقیقه، دمای محیط) و سپس عملیات شیمیایی با محلول متشکل از اسیدنیتریک 56 درصد، اسیدکلریدریک 37 درصد به نسبت حجمی 1:1 (20 ساعت، در دمای محیط)، نشان می دهد. با بررسی این شکل وجود چین خوردگی و از بین رفتن لایه­های سطحی آلیاژ نایتینول که ناشی از قابلیت خورندگی بالای محلول اسیدی است، مشخص است. همچنین انرژی سطح، تحت این شرایط بسیار بالا است؛ به طوری که ریزحفره­های ایجاد شده تحت اثر محلول اسیدی سه­تائی با عملیات سطحی بعدی از بین رفته و سطح صاف شده است.


 

 

شکل 1 : تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح نایتینول صیقل­کاری مکانیکی شده و اصلاح شده با a): عملیات A، b) عملیات B،

c): عملیات C، d) عملیات D،e ) عملیات E.


به ­منظور مطالعه بیشتر، علاوه بر میکروسکوپ الکترونی روبشی با استفاده از آنالیز میکروسکوپ نیروی اتمی AFM[1] مورفولوژی سطح مورد ارزیابی قرار گرفت و در این حالت R.M.S و Ra که نشان دهنده زبری سطح هستند با استفاده از این آنالیز محاسبه شدند. شکل
(2
-a-e)، تصاویر میکروسکوپ نیروی اتمی از ریخت­شناسی سطح آلیاژ حافظه­دار ناتینیول پولیش و اصلاح سطح شده در دو حالت دو بعدی و سه بعدی نشان می دهد. با بررسی شکل (2-a) مشاهده می‌شود، که سطح آلیاژ نایتینول حاوی خطوط و شیارهایی موازی شکل ناشی از انجام عملیات صیقل­کاری مکانیکی است. به­علاوه، این تصویر نشان می‌دهد اجرای عملیات صیقل­کاری مکانیکی، سطحی با حداقل زبری و فرورفتگی و برجستگی در مقیاس میکرون ایجاد می­نماید. در مقابل، اجرای این عملیات می­تواند سطح را در برخی نواحی دچار کندگی‌های موضعی در کمتر از مقیاس میکرونی نماید. تصویر AFM مربوط به سطح آلیاژ نایتینول پس از قرار گرفتن در محلول اسیدی 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک، در شکل (b-2) معلوم است. بررسی شکل (b-2) نشان می دهد، ریخت­شناسی سطح با انجام عملیات شیمیایی اسیدی دچار تأثیر چندانی نشده است. همچنین خطوط و شیارهای ناشی از عملیات پرداخت سطحی در مرحله قبل از بین رفته و تخلخل­های نامنظم سطحی به صورت محدود ایجاد شده که این امر در تصویر به­خوبی روشن است. با مشاهده شکل (c-2)، سطح تحت تأثیر قرار گرفته و بر روی سطح فرورفتگی و برآمدگی ایجاد شده است. این عامل، زبری سطح را افزایش داده است. شکل (d-2)، نتایج مربوط به ریخت­شناسی سطح آلیاژ نایتینول را در محلول اسیدی سه­تائی به همراه عامل ایجاد کننده گروه های زیستی بر روی سطح (کلسیم فلوراید)، نشان می دهد. تصویر AFM مربوط به این عملیات نشان می­دهد که محلول اسیدی تمرکز خوردگی شدیدی در نواحی داخل حفره­های سطحی داشته است؛ به­ طوری که حفرات بسیار ریزی در کمتر از مقیاس میکرونی بر روی سطح ایجاد شده است. لازم به ذکر است که وجود فلوراید کلسیم پتانسیل خوردگی محلول اسیدی سه­تائی را تحت تأثیر قرار داده است. همچنین حفرات ایجاد شده در اندازه کوچکتری نسبت به عملیات شیمیایی با اسیدنیتریک (شکل (c-2))، حاصل شده­اند. اما این موضوع نشان می دهد که در بعضی از نواحی، سطح تحت تأثیر محلول اسیدی قرار نگرفته است. شکل (2-e)، تصویر میکروسکوپ نیروی اتمی از سطح آلیاژ نایتینول را پس از اصلاح سطح تحت شرایط 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک، 7/1 گرم کلسیم فلوراید (10 دقیقه، دمای محیط) و سپس عملیات شیمیایی با محلول متشکل از اسیدنیتریک 56 درصد، اسیدکلریدریک 37 درصد به نسبت حجمی 1:1 (20 ساعت، در دمای محیط)، نشان می­دهد. این شکل وجود چین خوردگی و از بین رفتن لایه­های سطحی که می­تواند در اثر قابلیت بالای خورندگی محلول اسیدی باشد، آشکار می­کند. این موضوع در مورد تصویر میکروسکوپ الکترونی نیز مشخص بود. پستی و بلندی های سطح در این شرایط بسیار بالا بوده و تمام نقاط سطح آلیاژ تحت تأثیر واقع شده است. همچنین تأثیر اسیدکلریدریک در مرحله عملیات شیمیایی توانسته است که شرایط خوردگی سطح را تغییر دهد. بافت سطح از نظر وجود حفره­ها به شکل نیم­کره و هم اندازه ضعیف می باشد. مورفولوژی ترکیبی از حفره­هایی بسیار ریز و سطوح لایه برداری شده با پستی و بلندی بالا است.  


 

 

 

شکل 2 : تصویر میکروسکوپ نیروی اتمی از سطح نایتینول صیقل­کاری شده و اصلاح شده با a): عملیات A، b) عملیات B، c): عملیات C،

d) عملیات D، e) عملیات E.

 

نمودار 3-(a-b)، مقادیر میانگین زبری سطح (Ra) و میزان زبری سطح (R.M.S) از سطوح آلیاژ حافظه­دار صیقل­کاری مکانیکی شده و اصلاح شیمیایی شده را نشان می­دهد. در این راستا، بالاترین زبری سطح مربوط به عملیات سطحی مربوط به اجرای عملیات E است. همان­طور که از تصاویر میکروسکوپ نیروی اتمی مشخص است، مورفولوژی سطح آلیاژ حافظه­دار نایتینول با اجرای عملیات E به شکل به هم پیچیده بوده است. به­علاوه، ارتفاع پستی و بلندی­های سطح نیز در این حالت بالاتر از سایر گروه­های دیگر (A-D) می­باشد. گروه C که دارای تخلخل­های منظم بوده (شکل 2-c) و از اسیدنیتریک برای عملیات شیمیایی بعدی استفاده گردیده، زبری سطح کمتری نسبت به گروه E داشته است. اما، زبری سطح گروه C پس از گروه E بالاتر از بقیه گروه­های دیگر عملیات سطحی بوده است. سطح آلیاژ نایتینول صیقل­کاری شده دارای حداقل زبری بود. این امر برای عملیات اصلاح سطح با گروه B نیز صادق است.

نتایج حاصل از رشد و تکثیر سلول در روز سوم (نمودار 4-a) نشان می­دهد، دو نمونه‌ی E و D تفاوت معنی‌داری با گروه نیکل- تیتانیم کنترل داشته‌اند (3n= و 05/0P<). اما، غیر از دو گروه ذکر شده، تفاوت معنی‌داری بین گروه‌های دیگر مشاهده نشده است. اما، پس از شش روز کشت، میزان رشد و تکثیر سلولی بر روی سطوح آلیاژ حافظه­دار نایتینول اصلاح شیمیایی شده اختلاف قابل ملاحظه‌ای را با سطح اصلاح نشده نشان داد.


 

  نمودار 3 : مقادیر زبری سطح (a): متوسط زبری سطح (Ra) و (b) میزان زبری سطح (R.M.S) از سطوح نایتینول صیقل­کاری مکانیکی شده و اصلاح شیمیایی شده؛ )همه داده­ها بر حسب mean ± Standard Error (n = 3) گزارش شده­اند(.

 

 

 


ارزیابی‌های آماری نشان داد، تفاوت های معنی‌دار بسیار بالایی بین گروه‌های (C، D وE­) با سطح نیکل- تیتانیم اصلاح نشده (A) وجود دارد (3n= ، 001/0P<). همچنین بین گروه‌ B و گروه‌های (C، D وE­)، نیز این تفاوت قابل ملاحظه است اما، سطوح نیکل-تیتانیم اصلاح شده با محلول اسیدی 80 درصد اسید کلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک و سپس عملیات شیمیایی با محلول ترکیبی از اسیدکلریدریک و اسیدنیتریک (E)، به همراه محلول80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک، 7/1 گرم کلسیم فلوراید (D)، علاوه بر تفاوت‌های معنی‌دار با گروه کنترل، تفاوت‌های معنی‌داری نیز با سطوح نیکل-تیتانیم اصلاح شیمیایی شده، داشتند. مطالعه دیاگرام ستونی نشان می­دهد، گروه کنترل در روز ششم نسبت به روز سوم کاهش رشد و تکثیر سلولی را بر روی سطح خود داشته است و سلول‌های استخوان ساز نتوانسته‌اند بر روی سطح رشد و تکثیر یابند. این امر در حالی­ است که تمام سطوح اصلاح شده افزایش رشد و تکثیر را با افزایش زمان نشان می‌دهند. غیر از دو نمونه‌ی E و D که در روز سوم و ششم بالاترین میزان رشد و تکثیر را داشتند، نمونه‌ C در روز ششم نسبت به روز سوم افزایش بیشتری در رشد و تکثیر سلولی بر روی سطح خود نشان داد. به­علاوه، برای دو متغیر میزان زبری سطح Ra و یا RMS و فعالیت حیاتی، آنالیز واریانس دو عاملی انجام شد و مقادیر توصیفی و تحلیلی آن به صورت جدول­ 2 و جدول 3 ارائه شده­ است.


 

 

 

 

 

نمودار 4 : فعالیت حیاتی رشد و تکثیر  سلول‌های استخوان‌ساز بر روی سطوح نیکل- تیتانیم اصلاح شده و گروه کنترل پس از a): سه روز کشت و b): شش روز کشت.

 

 

 

 

 

جدول 2 : میانگین و انحراف معیار فعالیت حیاتی و با متغیر میزان زبری سطح (Ra و یا RMS) بر حسب مدت زمان و گروه

 

3 روز

انحراف معیار ± میانگین

6 روز

انحراف معیار ± میانگین

A

414/10±0/128

14/36±0/218

B

260/11±7/139

26/22±3/261

C

144/15±0/158

68/27±0/454

D

566/11±7/202

24/23±3/475

E

170/13±3/202

02/11±0/519

نتیجه آزمون

237/0P=               61/3F=   : زمان

520/0P=                  89/1F=    :گروه ها


 

 


نتایج چسبندگی سلولی (نمودار 5)، نشان می‌دهد، دو نمونه‌ (C) و (E) بالاترین میزان چسبندگی سلول را به سطح خود داشته‌اند. اما، نمونه‌هایی که بالاترین میزان زبری را داشته‌اند (نمونه‌هایی که با محلول 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسید فلوئوریدریک، 10 درصد اسید فسفریک اصلاح شده‌اند و سپس از اسیدنیتریک به عنوان عملیات بعدی استفاده شده­اند)، نسبت به سایر نمونه‌ها میزان چسبندگی بالاتری را نشان داده‌اند. در نمونه (E) که بیشترین زبری را در مقیاس نانو داشت، این میزان حداکثر و برای نمونه‌ی (C) نیز این مقدار بالا بود. ملاحظات آماری تفاوت قابل توجهی را بین نمونه‌ (E) و گروه کنترل نشان داد (3n= و 001/0P<). تفاوت معنی‌داری نیز بین نمونه‌ (C) و نمونه (B) و همچنین نمونه (E) و نمونه (A) وجود داشت (3n= و 001/0P<). همچنین ملاحظات آماری تفاوت قابل توجهی را بین نمونه‌ (C) و گروه (B) نشان داد ( 3n= و01/0P<).


 

 

 

جدول 3 : مقادیر میانگین و انحراف استاندارد عملیات های سطحی برای چسبندگی سلول

Group

Mean

Standard Deviation

A

33/123

275/15

B

33/153

092/45

C

67/272

526/20

D

33/208

629/23

E

00/310

056/36

 

 

 

 

نمودار 5 : تعداد سلول‌های استخوان ساز چسبیده بر روی سطوح نیکل- تیتانیم اصلاح شده و گروه کنترل پس از 16 ساعت کشت.

 

 

 


بحث

این موضوع نشان می­دهد که تأثیر عملیات شیمیایی بعدی با محلول اسیدی دوتائی که متشکل از اسیدکلریدریک و اسیدنیتریک (با حضور نمک NaCl) بر روی مورفولوژی و ریخت­شناسی سطح تأثیرگذار خواهد بود.

دلیل این موضوع را می­توان تنها حذف خطوط ناشی از اجرا صیقل­کاری مکانیکی بر روی سطح آلیاژ و عدم تغییرات ریخت­شناسی سطح آلیاژ توسط این محلول اسیدی (گروه B) دانست.     

استفاده از عملیات اصلاح شیمیایی برای آلیاژ حافظه دار می­تواند ریخت­شناسی سطح را تغییر دهد به طوری که، فرآیند اصلاح سطح با محلول اسیدی سه­تایی و سپس به کار بردن عملیات شیمیایی با اسیدنیتریک بر روی سطح، ایجاد فرورفتگی و برآمدگی در مقیاس میکرون نمود (شکل 1-c). بنابراین، می­توان نقش محلول اسیدی را به عنوان یک پیش عملیات برای اصلاح سطح لازم دانست زیرا، این رفتار می­تواند در چسبندگی و رشد و تکثیر استخوان بر روی سطح موثر تلقی شود. همین­طور بایستی به تشکیل ترکیبات کمپلکس به ازای افزودن سدیم کلراید به محلول اسیدی اشاره نمود. در این شرایط، بافت سطح دارای حداکثر میزان فرورفتگی‌ با شکل‌های یکنواخت است. قرار گرفتن نایتینول در محلول اسیدی سه­تائی به همراه عامل ایجاد کننده گروه­های عاملی زیستی بر روی سطح که در شکل (1-d) آمده است، نشان می‌دهد، ترکیب عوامل زبر کننده سطح  (محلول اسیدی سه­تائی) همراه با فلوراید کلسیم، شرایط خوردگی سطح و پتانسیل خوردگی محلول را تحت تأثیر قرار داده است. همچنین حفرات با اندازه کوچکتری نسبت به عملیات شیمیایی با اسیدنیتریک (شکل (1-c)) ایجاد شده است. در نتیجه، از نقطه نظر مورفولوژی سطح آلیاژ نایتینول­، تصاویر مربوط به میکروسکوپ الکترونی روبشی شکل (1-c-d) حفراتی با مقیاس میکرون بر روی سطح را، تأئید می­نمایند. این حفرات سطحی تقریباً مشابه به یکدیگر و به شکل نیم کره‌های کوچک می‌باشند، اما تحت تأثیر نوع محلول اسیدی و اعمال عملیات شیمیایی بعدی بر روی سطح، اندازه این نیم کره‌ها متفاوت بوده و مورفولوژی نیز به شدت تغییر خواهد نمود. به­علاوه، تصویر میکروسکوپ نیروی اتمی مربوط به این عملیات (شکل (2-d)) تمرکز خوردگی شدیدی در نواحی داخل حفره­های سطحی را نشان می­دهد؛ به­طوریکه حفرات بسیار ریزی در کمتر از مقیاس میکرونی بر روی سطح ایجاد شده است. لازم به ذکر است که وجود فلوراید کلسیم، پتانسیل خوردگی محلول اسیدی سه­تائی را تحت تأثیر قرار داده است. مقایسه شکل (1-e) با تصاویر 1-(b-d)، وجود چین خوردگی و از بین رفتن لایه­های سطحی آلیاژ نایتینول که ناشی از قابلیت خورندگی بالای محلول اسیدی است را نشان می­دهد. همچنین انرژی سطح تحت این شرایط بسیار بالا است(7)؛ به طوری که ریز حفره­های ایجاد شده تحت اثر محلول اسیدی سه­تائی با عملیات سطحی بعدی از بین رفته و سطح صاف شده است. با افزایش زمان قرار گرفتن سطح آلیاژ در محلول اسیدی ذکر شده، انتظار می رود که خوردگی از حالت متمرکز خود خارج گردیده و سطح، تحت خوردگی شدید واقع می­شود. در نتیجه، بافت سطحی مرجع ایجاد نمی­شود.(8و7) همچنین بالاترین مقادیر زبری سطح تصاویر 3-(a-b) مربوط به عملیات سطحی E بود. این موضوع نشان می­دهد که تأثیر عملیات شیمیایی بعدی با محلول اسیدی دوتائی که متشکل از اسیدکلریدریک و اسیدنیتریک (با حضور نمک NaCl) بود. بر روی مورفولوژی و مورفولوژی سطح، تأثیرگذار است. زبری سطح در مقیاس میکرون تأثیر عمده‌ای بر فعالیت سلولی و خاصیت زیست‌ مکانیکی در نتیجه‌ ایجاد قفل‌های مکانیکی بین بافت و ماده­کاشتنی دارد. دلیل این امر را می‌توان در رشد و تکثیر سلول‌ها و بافت‌های استخوانی درون حفره‌های با مقیاس میکرون سطح ماده ­کاشتنی جستجو نمود. لذا، با بررسی نتایج مربوط به چسبندگی و رشد و تکثیر سلولی، تعیین شد که نمونه‌ E که دارای بالاترین زبری سطح (R.M.S) بود، از چسبندگی و رشد و تکثیر سلولی قابل توجهی بر روی خود برخوردار بوده است. گروه B نیز زبری سطح تقریباً مشابهی را با گروه کنترل نشان داد. دلیل این امر را می­توان تنها حذف خطوط ناشی از اجرای صیقل­کاری مکانیکی بر روی سطح آلیاژ و عدم تغییرات ریخت­شناسی سطح آلیاژ توسط این محلول اسیدی (عملیات سطحی B) دانست.     

به دلیل تأثیر قابل ملاحظه اسیدنیتریک در تغییر ریخت­شناسی سطح و به­منظور تحلیل برهم­کنش این اسیدبا سطح نمونه، واکنش­های شیمیایی زیر بیان شده­اند. بطوریکه، قرار گرفتن آلیاژ حافظه­دار در محلول HNO3 سطح آن­را دچار خوردگی انتخابی خواهد نمود. لذا، ابتدا نمونه­های فعال نیکل بر روی سطح ماده حل شده و در نهایت اکسید تیتانیم بر طبق واکنش زیر بر روی سطح ایجاد می­شود. 

3Ni+8HNO3=3Ni(NO3)2+2NO +H2O

 

 
   

 

3Ti+4HNO3+H2O=3TiO2.H2O+4NO

   

بنابراین، زمانی­که آلیاژ نایتینول با محلول آبدار اصلاح می­شود، لایه اکسیدی اساساً از نوع TiO2 و یا TiO بر روی سطح تشکیل خواهد شد. به­علاوه، TiO2 زیست سازگاری بهتری نسبت به Ti دارد، و وجود یک لایه سطحی از TiO2 می­تواند از آزاد شدن بالقوه نیکل زیرلایه NiTi جلوگیری نماید.(2) مطالعات دیگری که از روش هیدروترمال و عملیات قلیایی– حرارتی جهت افزایش زیست­فعالی سطح آلیاژ نایتینول استفاده شده  نیز مبین وجود لایه­ای از اکسید تیتانیم در سطح است.(10و3)

سطح آلیاژ نایتینول محلول اسیدی سه­تائی 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک (10 دقیقه، دمای محیط) به تنهایی تاًثیر چندانی در ایجاد تخلخل‌های با مقیاس میکرون نداشت (شکل 1-b)، اما محلول اسیدی سه‌تائی می­تواند  سبب شکستن لایه اکسیدی و تشکیل تیتانیا بر روی سطح بود که این موضوع شرایط را برای اعمال عملیات شیمیایی بعدی و اصلاح سطح آلیاژ مذکور فراهم ­نماید. زبری سطح می­تواند نقش مهمی در تشکیل لایه شبه آپاتیت بر روی سطح زیست ماده ایفا نماید.(6) از طرفی بایستی به گسترد‌گی حفرات بر روی سطح نایتینول ناشی از تغییر شرایط محلول اسیدی اشاره نمود. در نمونه D که بیشترین گستردگی را از نظر حفره‎های سطحی داشت (5/0 تا 7 میکرون)، رشد و تکثیر سلولی قابل ملاحظه‌ای مشاهده شد. این امر در حالی است که تحقیقات دیگر مربوط به مورفولوژی، سطحی با اندازه‌های حفرات 6 تا 10 میکرون و یا 5/0 تا 2 میکرون را به عنوان سطحی ایده آل از رشد و تکثیر سلول در نظر گرفته بوده‌اند.(20و19) قابلیت چسبندگی سلول به سطح برای گروه‌هایی از نایتینول که با اسیدنیتریک اصلاح شده­ بودند، مقدار بیشتری را نشان می‌­داد که می‌توان علت آن را به افزایش بیشتر در زبری سطح ناشی از درصد این اسید دانست.(21) لازم به ذکر است که نقش ریخت­­شناسی حفره‌های سطح نیز از اهمیت خاصی در روند رشد و تکثیر سلول برخوردار است.(19) در تمام حالت‌های فوق سطح آلیاژ نایتینول بدون عملیات اصلاح سطحی (گروه Control) از نظر رشد و تکثیر و چسبندگی سلول در مقایسه با سطوح اصلاح شده بسیار ضعیف عمل نموده بود. همچنین بافت رشته‌ای (کپسول فیبروزه­ای) که از تماس مستقیم استخوان به کاشتنی جلوگیری می‌نماید، در این‌حالت تشکیل شده بود.

به­طور کلی، در حدود دو دهه پیش مطالعاتی برای گسترش سطوح تیتانیمی غیرپوششی آغاز گردید. میکروتوپوگرافی سطح می‌تواند بر تعداد و مورفولوژی پاهای کاذب چسبنده سلول و جهت‌گیری سلول‌ها (استئوبلاست‌ها) تأثیر گذاشته و مهاجرت سلول‌ها به­داخل حفره‌های موجود در سطح ماده کاشتنی را هدایت کرده و در نتیجه رشد استخوان را افزایش دهد. این موضوع، با انرژی سطحی ایمپلنت و به عبارت دیگر میزان آبدوستی سطح می­تواند ارتباط یابد.(7و6) لذا، ترشوندگی سطح همچنین در جهت چسبندگی بالاتر پروتئین‌ها پیشنهاد شده است. چسبندگی پروتئین‌ها، مهاجرت سلول‌های استخوان ساز در طول سطح را آماده می‌کند. بنابراین، در مورد نمونه ‌E که بیشترین زبری سطح را دارا بود، چسبندگی و رشد و تکثیر سلولی بالاتری را می­توان در مقایسه با نمونه­های دیگر انتظار داشت. از مطالب بالا می توان گزارش کرد که زبری و شیمی سطح نقش فوق العاده مهمی را در رفتار سلول بر روی سطح ایمپلنت ایفا می­نماید.(21-20و9) به­علاوه، گزارش شده است که جذب فیبرونکتین روی سطوح خشن کمتر از سطوح صاف است. فیبرونکتین یک گلیکوپروتئین است که به طور سریعی به سطوح سخت چسبیده و در نتیجه باعث چسبیدن سلول‌های دیگر می‌شود.(23) همچنین در تحقیقی دیگر نشان داده شد که سطوح اصلاح شده با عملیات اسیدی نسبت به عملیات قلیایی دارای تأثیر بارزتری بر نحوه رشد آپاتیت بوده و استوکیومتری نزدیک‌تری از نسبت کلسیم به فسفات (55/1) در پوشش شبه استخوانی آپاتیت روی سطوح خود ایجاد می‌نماید.(6)

ایمپلنت تیتانیم در مقابل یون­های فلوراید بسیار فعال بوده و تترا فلوئورید تیتانیم را تشکیل می‌دهد. سطح تولید شده دارای توپوگرافی با زبری میکرون، است. به هر حال عملیات اسیدی نظیر اسید فلوئوریدریک می‌توانند جهت ایجاد توپوگرافی‌ها در مقیاس نانو، که به صورت معمول به عنوان ساختارهایی که حداقل یکی از ابعادشان در محدوده یک تا صد نانومتر است، استفاده شوند.(7) این عملیات شیمیایی، علاوه بر ایجاد یک سطح زبر منجر به حضور یون فلوراید در سطح تیتانیم می شود که تلفیق آنها به منظور همبندی استخوان کاشتنی تیتانیم با بافت استخوانی مساعد است.(8و7) این موضوع برای آلیاژ نایتینول مشاهده نشد؛ زیرا عنصر نیکل نسبت به یون­های فلوئور مقاومت به خوردگی خوبی دارد. اما، استفاده از عملیات شیمیایی با اسیدنیتریک می­تواند آلیاژ نایتینول را از لحاظ مورفولوژی سطح و همچنین تغییر لایه اکسیدی اصلاح نماید.(2) اصلاح شیمیایی سطح، تفکیک سلول‌های استخوان ساز را در مقایسه با نمونه‌های اصلاح نشده بالا می‌برد. همچنین این فرآیند قادر است پتانسیلی در جهت بهبود بالاتر تکیه‌گاه کاشتنی در استخوان توسط ارائه سطح کاشتنی زیست فعال، ارائه دهد.

نتیجه‌گیری

سطح آلیاژ نایتینول تغییرات قابل توجهی را زمانی­که تحت محلول اسیدی متشکل از اسیدهای سه‌تائی
(HCl-HF-H3PO4) همراه عملیات شیمیایی بعدی با اسیدنیتریک قرار می­گیرد، نشان می­دهد. این موضوع منجر به ایجاد حفره‌های با مقیاس میکرون بر روی سطح می‌شود. اسیدنیتریک در بروز حفره­ها با مقیاس میکرون بسیار موثر است. غیر از اسیدنیتریک که مسئول اصلی در ایجاد زبری در سطح تیتانیم می‌باشد، اسیدکلریدریک به تغییر مورفولوژی سطح نیز کمک می­نماید. به‌طور کلی، ارزیابی‌های کشت سلولی نشان داد که استفاده از محلول اسیدی متشکل از اسیدهای سه‌تائی (HCl-HF-H3PO4) همراه عملیات شیمیایی بعدی با اسیدنیتریک باعث افزایش قابلیت سطح نایتینول در چسبندگی و رشد و تکثیر سلولی می‌شود. بنابراین، استفاده از عملیات شیمیایی روشی آسان در زیست‌فعال کردن سطح آلیاژ نایتینول است. نتایج این تحقیق بر اساس آزمایش‌ها در خارج از محیط بدن بوده لیکن می­تواند نتایج مشابهی را با آزمایش­های درون بدن نشان ‌دهد.   

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله بر خود لازم می­دانند از معاونت پژوهشی دانشگاه سمنان، دانشکده مهندسی مواد و متالورژی دانشگاه سمنان، گروه پژوهشی بایونانو مواد زیست فعال دانشگاه سمنان و پژوهشگاه مواد و انرژی کرج به دلیل حمایت از مقاله حاضر تشکر نمایند. 



[1]. Atomic force microscope (AFM)

  1. Chu CL, Chung CY.Bioactive NiTi shape memory alloy fabricated by oxidizing in H2O2 solution and subsequent NaOH treatment. J Mat Sci 2006; 41(5): 1671-4.
  2. Chen MF, Yang XJ, Liu Y, Zhu SL, Cui ZD, Man HC. Study on the formation of an apatite layer on NiTi shape memory alloy using a chemical treatment method. Surface and Coatings Technology 2003; 173(2): 229-34.
  3. Qiang W, Zhen-duo C, Xian-jin Y, Jie S. Improving the bioactivity of NiTi shape memory alloy by heat and alkali treatment. Appl Sur Sci 2008; 255(2): 462-5.  
  4. Cheng WY, Cai HT, Li Y, Zheng F. Surface modification of NiTi alloy with tantalum to improve its biocompatibility and radiopacity. J Mat Sci 2006; 41(15): 4961-4.
  5. Chu CL, Wang RM, Hu T, Yin LH, Pu YP, Lin PH, et al. XPS and biocompatibility studies of titania film on anodized NiTi shape memory alloy. J Mat Sci: Mat Med 2009; 20(1): 223-8.
  6. Yousefpour M, Afshar A, Chen J, Xingdong Z. Bioactive layer formation on alkaline-acid treated titanium in simulated body fluid. Mater Des2007; 28(7): 2154-9.
  7. Zareidoost A, Yousefpour M, Ghaseme B, Amanzadeh A. The relationship of surface roughness and cell response of chemical surface modification of titanium. J Mat Sci: Mat Med 2012; 23(6):1479-88.
  8. Zareidoost A, Yousefpour M, Ghaseme B. Surface modification of titanium dental implants due to chemical method by a mixed solution of three acids. J Mash Dent Sch 2011; 35(2): 85-98. (Persian)
  9. Liu X, Chu PK, Ding C. Surface modification of titanium, titanium alloys,and related materials for biomedical applications. Mat Sci Eng 2004; 47: 49-121. 
  10. Cheng FT, Shi P, Man HC. A preliminary study of TiO2 deposition on NiTi by a hydrothermal method. Surface & Coatings Technology 2004; 187(1): 26-32.
  11. Gu Y.W, Tay BY, Lim CS, Yong MS. Biomimetic deposition of apatite coating onsurface-modified NiTi alloy. Biomaterials 2005; 26(34): 6916-23.
  12. Chu CL, Chung CY, Pu YP, Lin PH. Graded surface structure in chemically polished NiTi shape memory alloy after NaOH treatment. Scripta Materialia 2005; 52(11): 1117-21.
  13. Wirth C, Comte V, Lagneau C, Exbrayat P, Lissac M, Renault JN, et al. Nitinol surface roughness modulates in vitro cell response: A comparison between fibroblasts and osteoblasts. Mat Sci Eng 2005; 25(1): 51-60.
  14. Sun T, Wang M. Low-temperature biomimetic formation of apatite/TiO2 composite coatings on Ti and NiTi shape memory alloy and their characterization. App Surf Sci 2008; 255(2): 396-400.  
  15. Chen MF, Yang XJ, Liu Y, Zhu SL, Cui ZD, Man HC. Study on the formation of an apatite layer on NiTi shape memory alloy using a chemical treatment method. Sur Coat Tech 2003; 173(2-3): 229-34.
  16. Xiao-Xiang W, Satoshi H, Kanji T, Akiyoshi O. Bioactive titania gel layers formed by chemical treatment of Ti substrate with a H2O2/HCl solution. Biomaterials 2002; 23(5): 1353-7.
  17. Frauchigera VM, Schlottigb F, Gasserc B, Textora M. Anodic plasma-chemical treatment of CP titanium surfaces for biomedical applications. Biomaterials 2004; 25(4): 593-606.
  18. Xiaohui RF, Zhe Q, Marco W, Michael M, Andreas S.Differentiation and cytokine synthesis of human alveolar osteoblasts compared to osteoblast-like cells (MG63) in response to titanium surfaces. Dent Mater 2008; 24(1): 102-10.
  19. Juodzbalys G, Sapragoniene M, Wennerberg A. New acid etched titanium dental implant surface. Bal Den and Maxillofac J 2003; 5: 101-5.
  20. Guehennec LL, Soueidan A, Layrolle P, Amouriq Y. Surface treatments of titanium dental implants for rapid osseointegration. Dent Mater 2007; 23(7): 844-54.
  21. Lamolle FS, Monjo M, Rubert M, Haugen HJ, Lyngstadaas SP, Ellingsen JE. The effect of hydrofluoric acid treatment of titanium surface on nanostructural and chemical changes and the growth of MC3T3-E1 cells. Biomaterials 2009; 30(5): 736-42.
  22. Mendonca G, Mendonca DBS, Aragao JL, Francisco LF. Advancing dental implant surface technology from micron to nanotopography. Biomaterials 2008; 29(28): 3822-35.
  23. Sargolzaie N, Ghanbary H, Mohammadzadeh Rezaee Y. The effect of two types of implant surface coating on bone and surrounding tissues of prosthesis with implant supporting. J Mash Dent Sch 2008; 32(3): 207-12. (Persian)