تأثیر عملیات اسیدی دو مرحله‌ای بر رفتار سطح و بهبود زیست فعالی آلیاژ نایتینول

مقدمه

آلیاژهای نایتینول با درصد اتمی برابر از نیکل و تیتانیم، به عنوان کاشتنی فلزی در ارتوپدی قابل کاربرد هستند؛ این موضوع به دلیل خواص فوق کشسانی و مقاومت به خوردگی آن­ها است.^(3-1) با وجود استفاده کلینیکی رضایت­بخش از آلیاژهای نایتینول در بعضی شرایط، حضور نیکل بالا در آلیاژ برای زیست­سازگاری آن­ها بسیار نگران کننده است.^(4-1) زیست فعالی در آلیاژهای نایتینول را می­توان با روش­های مختلفی مانند پاشش پلاسمایی، عملیات گرمابی، رسوب دادن به کمک پرتو یونی، روش سل-ژل و عملیات­ شیمیایی ساده برای آماده سازی سطح مانند استفاده از محلول­های قلیایی (هیدروکسید سدیم) و یا اصلاح شیمیایی سطح با محلول اسیدی و همچنین عملیات اکسیداسیون با محلول پراکسید هیدروژن (H₂O₂) ایجاد نمود.^(18-10و4-1) عملیات قلیایی لایه تیتانات سدیم بر روی سطح تیتانیم تولید
می نماید؛^(12-11و2-1) در حالی­که عملیات با پراکسید هیدروژن تشکیل لایه ژلی از تیتانیا بر روی سطح می دهد.⁽¹⁾ این موضوع در حالی است که هر دو لایه تیتانات سدیم و ژلی تیتانیا توانایی ایجاد رسوب آپاتیت شبه استخوانی در محیط آزمایشگاهی و کلینیکی بر روی خود را دارند و از این منظر، زیست فعال تلقی می شوند.^(2و1)

همچنین عملیات قلیایی در زیست فعال نمودن سطح زیست­ مواد دیگر مانند تانتالیم نیز موثر پیشنهاد شده است. همچنین پیشنهاد شده است که اصلاح سطح تیتانیم با اچ اسیدی می­تواند تأثیر مثبت بر روی یکپارچگی کاشتنی­ها در استخوان داشته باشد.^(9-7) در یک مطالعه، رفتار استخوان به سطح زیست ماده (که سطح آن ماشین کاری شده و سپس با استفاده از محلول
HCl-H₂SO₄ اصلاح شیمیایی سطح با محلول اسیدی شده است) نشان از افزایش قابلیت زیست سازگاری در کاشتنی دارد.⁽⁹⁾ در این راستا، مطالعه قبلی نویسندگان مقاله که تأثیر محلول اسیدی سه­تایی (HCl-HF-H₃PO₄) بر روی سطح کاشتنی تیتانیم خالص تجارتی بوده است، نیز موید این مطلب هست.⁽⁷⁾ اما در مورد آلیاژهای نایتینول در بعضی شرایط، حضور عنصر نیکل بالا در آلیاژ برای زیست سازگاری آن­ها مشکل ساز است.^(2و1) عنصر نیکل در ایجاد رفتارهای آلرژیک و سمیت­های کلینیکی موثر است.⁽²⁾ چندین پژوهشگر گزارش نموده­اند که اگر یون­های نیکل از سطح آلیاژ در تماس با سیال بیولوژیکی بدن آزاد شود این امر می­تواند مشکل جدی برای بافت اطراف ماده کاشتنی ایجاد نماید.^(15و2) به­علاوه، گزارش شده است که اصلاح سطح آلیاژ با استفاده از عملیات شیمیایی سطح می­تواند از آزاد شدن عنصر نیکل به واسطه تشکیل یک لایه همگن و پایدار از اکسید­های تیتانیم جلوگیری نماید؛ که نتیجه حاصل در بهبود قابلیت زیست سازگاری ماده بسیار موثر است.^(12و2) همچنین در یک مطالعه برای ایجاد خاصیت زیست فعالی در سطح، از اسیدکلریدریک و پراکسید هیدروژن استفاده گردیده است.⁽¹⁶⁾ در نهایت سیر تحقیقاتی در این زمینه نشان می دهد که اهداف دنبال شده برای اصلاح و ارتقاء زیست­سازگاری سطح نایتینول است.^(14-10) لذا، هدف از این پژوهش، بررسی رفتار سطح آلیاژ نایتینول در حضور محلول­های اسیدی قوی و به دنبال آن تأثیر این عملیات بر افزایش قابلیت زیست سازگاری سطح این آلیاژ است. به علاوه، در این تحقیق از یک ایده جدید برای حضور کلسیم در سطح آلیاژ که به عنوان یک روش تقلید زیستی نیز مطرح است، استفاده شده است.^(11و8-6)

مواد و روش ها

روش به کار رفته در این تحقیق از نوع آزمایشگاهی بود. نمونه­های آلیاژ نایتینول) 5/50 درصد اتمی نیکل) به صورت دیسکی شکل با قطر mm 5 و ضخامت mm 1 به تعداد 75 نمونه برای اصلاح شیمیایی سطح، ارزیابی­های بیولوژیکی و زبری سطوح و همچنین 9 نمونه به عنوان شاهد انتخاب شدند. سپس سطح نمونه‌ها با استفاد از سنباده‌های با شماره‌های به ترتیب 280، 320، 500، 600 مورد عملیات صیقل­کاری مکانیکی قرار گرفتند.⁽⁶⁾ پس از انجام عملیات صیقل­کاری مکانیکی برای حذف آلودگی‌های سطحی و بدست آوردن یک سطح تمیز برای انجام عملیات اصلاح سطح، نمونه­ها در یک محفظه اولتراسونیک شستشو داده شدند. در این راستا، نمونه‌های صیقل­کاری مکانیکی شده با 40 درصد حجمی هیدروکسید سدیم (NaOH) و 50 درصد حجمی اسید نیتریک (HNO₃) در محفظه التراسونیکی (ATSmall, Iran) که دارای فرکانس 40 هرتز (توان 240 وات) و تایمر مکانیکی (گرمکن 200 وات) به مدت 15 دقیقه بود، شستشو داده شدند. سپس با تخلیه محلول شستشو، مجدداً نمونه‌ها با آب مقطر در محفظه اولتراسونیک شستشو داده شده و نهایتاً در درجه حرارت محیط در الکل اتانول 70 درصد حجمی نگهداری شدند.⁽⁷⁾

نمونه‌های آلیاژ حافظه­دار تمیز شده مطابق جدول 1، در محلول‌های اسیدی قرار گرفتند و عملیات اصلاح سطح به روش شیمیایی بر روی آن­ها انجام شد. لازم به ذکر است، انتخاب نوع اسید و شرایط محلول اسیدی به مطالعه قبلی نویسندگان مقاله در زمینه اصلاح سطوح زیست مواد بر می­گردد.^(8-6)  

هر کدام از محلول‌های اسیدی فوق به حجم 10 سی‌سی در بشرهای پلاستیکی تهیه شدند و به مدت یک روز نگهداری گردیدند. سپس تعداد 9 عدد نمونه نایتینول برای هر کدام از عملیات­های اصلاح شیمیایی سطح انتخاب شدند و همچنین 9 نمونه به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. سپس نمونه­های نایتینول در هر کدام از محلول‌های اسیدی، به مدت زمان 10 دقیقه برای عملیات اصلاح شیمیایی سطح  و 20 ساعت برای عملیات شیمیایی (به همراه مقدار بسیار کم از نمک سدیم کلراید برای ایجاد ترکیبات کمپلکس و تسریع واکنش خوردگی در سطح آلیاژ حاوی نیکل) در درجه حرارت محیط قرار گرفتند. بعد از انجام عملیات شیمیایی سطح، نمونه‌ها از محلول‌های با غلظت مشخص خارج شده و بلافاصله با آب مقطر و بعد با استون در محفظه التراسونیک شستشو داده شدند و بعد با استفاده از خشک‌‌کن الکتریکی، سطح نمونه‌ها در هوای معمولی خشک شد و سپس نمونه‌ها در دسیکاتور قرار گرفتند تا بررسی‌های لازم بر روی سطح آنها، صورت گیرد.

به­منظور بررسی مورفولوژی سطح نمونه­ها، تحلیل میکروسکوپ الکترونی روبشی (Sem، VegaTescan) با ولتاژ 20 کیلوولت انجام گردید. به­علاوه، برای  بررسی ریخت­شناسی و زبری سنجی سطح، از میکروسکوپ نیروی اتمی (Auto Probe, Scientific Park Instruments, Usa, Afm)  استفاده شد. 

سلول استخوان‌ساز (MG-63) با استفاده از محیط کشت (DMEM, GIBCO, Scotland) و افزودن 10 درصد سرم جنین گوساله FCS, Seromed, Germany)) به همراه آنتی‌بیوتیک به میزان 100 پنی سیلین و  100 استرپتومایسین (Sigma, USA) تکثیر گردید تا سلول برای دو نوع ارزیابی بررسی چسبندگی و رشد و تکثیر سلولی آماده شود:^(19و9)

به منظور ارزیابی میزان رشد و تکثیر سلولی از روش MTT استفاده گردید.⁽⁹⁾ روش MTT معمولاً برای بررسی بقاء سلول‌ها به کار می‌رود که استفاده از نمک زرد رنگ تترازولیوم است که این نمک بوسیله سلول‌ها جذب و سبب تشکیل کریستال‌های بنفش رنگ نامحلول فرمازان می‌گردد. در واقع این روش، براساس فعالیت آنزیم میتوکندریال سلولی استوار است. براین اساس، برای بررسی میزان رشد و تکثیر سلول بر روی سطح نمونه‌های تیتانیم دو زمان 3 و 6 روز در نظر گرفته شد. به علاوه، از تعداد   104 بر روی سطح نمونه‌های نایتینول استفاده گردید. لذا، با توجه به تکرار آزمایش­ها تا 3 مرتبه و زمان‌های ذکر شده در بالا تعداد 6 پیلت 96 حفره‌ای انتخاب شد که در هر کدام از آن‌ها یک دسته از گروه‌های انتخابی A تا D قرار داشت. برای تهیه محلول MTT با غلظت  5،  mg50 از پودر MTT در mg10 از PBS، 15/0 مولار حل شد و هنگام استفاده در رنگ آمیزی 10 برابر با PBS رقیق گردید تا محلول   5/0 MTTبه دست آید.

جدول 1 : شرایط عملیات اصلاح شیمیایی سطح بر روی گروه­های آلیاژ حافظه­دار

لازم به ذکر است که پس از تهیه PBS، محلول اتوکلاو گردید. پس از انکوباسیون سلول‌های MG-63 بر روی سطوح در فواصل زمانی 3 و 6 روز، پلیت­هایی که در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5 درصد دی اکسید کربن انکوبه شده بودند با محلول   5/0 MTT رنگ آمیزی شدند. پس از 3 تا 5 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتی‌گراد، مایع رویی سلول‌ها برداشته شد و به جای آن 200 میکرولیتر محلول ایزوپروپانال (Merck, Germany) به حفره‌های مربوطه اضافه شد. پلیت‌های مربوطه به مدت 10 الی 15 دقیقه روی شیکر قرار گرفت. سپس پلیت‌‌های مربوط توسط یک میکروتیتر ریدر در570  نانومتر قرائت شد.⁽⁸⁾

برای آزمون چسبندگی سلولی، روش تریپان بلو استفاده شد. در این روش، غشاء سلول‌های زنده اجازه ورود رنگ‌های غیر الکترولیت را به درون سلول نمی‌دهند، اما سلول‌های مرده به خوبی رنگ می‌گیرند. با افزودن محلول تریپان بلو به PBS 15/0 مولار و سپس قرار دادن بر روی سطوح کشت داده شده درون چاهک­های پلیت، سلول‌های مرده رنگ گرفته و از سلول‌های زنده (بی‌رنگ) قابل تمایز هستند. سپس با کمک یک هیستومتر (لام نئوبار) تعداد سلول‌های رنگ گرفته (مرده) و تعداد سلول‌های زنده ( بدون رنگ) تعیین می­شوند.⁽⁸⁾ به منظور آزمون چسبندگی سلول، تعداد 6000 سلول بر روی سطح هر نمونه قرار گرفت (به منظور رسیدن به مقدار مورد نظر برای کشت ظرف کشت در انکوباتور قرار داده شد) و به مدت 16 ساعت بر روی سطح نمونه‌های نایتینول کشت داده شد.

برای تحلیل نتایج حاصل از زبری سطح و ارزیابی­های زیستی از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون توکی استفاده شد. سطح معنی­داری در آزمون­ها 05/0 در نظر گرفته شد­.

یافته ها

در شکل 1، تصویر میکروسکوپ الکترونی از سطح نایتینول صیقل­کاری مکانیکی شده، آمده است. با بررسی این شکل، مشاهده می‌شود که سطح دارای خطوط شیاردار و موازی است. (شکل a-1). وقتی‌که، سطح آلیاژ حافظه­دار صیقل­کاری مکانیکی شده، در محلول 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک به مدت 10 دقیقه و در درجه حرارت محیط قرار می‌گیرد، این محلول اسیدی تأثیر چندانی در ایجاد و بروز تخلخل‌های سطحی بر روی آلیاژ ندارد (شکل b-1). همچنین در تصویر، شیارهایی ناشی از صیقل­کاری مکانیکی و کندگی‌های سطحی ناشی از خورندگی اسید به چشم می‌خورد. لذا، این محلول اسیدی با شرایط ذکر شده در بالا، قابلیت ایجاد حفرات با ابعاد میکرون را بر روی سطح نمی‌تواند داشته باشد. شکل (c-1)، سطح آلیاژ حافظه­دار را پس از قرار گرفتن در محلول مربوط به گروه C نشان می­دهد. همچنین حفرات ایجاد شده، تقریباً به شکل منظم بوده و از شکل هندسی کروی (تخلخل­های کروی شکل) پیروی می‌کنند. نتایج مربوط به قرارگرفتن نایتینول در محلول اسیدی سه­تائی به همراه عامل ایجاد کننده گروه­های زیستی بر روی سطح (کلسیم فلوراید)، در شکل (d-1) آمده است که حفرات سطحی با اندازه کوچکتر نسبت به عملیات شیمیایی با اسیدنیتریک را نشان می­دهد. به­علاوه، در بعضی از نواحی، سطح تحت تأثیر محلول اسیدی قرار نگرفته است. در نتیجه، بافت سطحی مرجع ایجاد نشده است. شکل (e-1)، عملیات اصلاح سطح آلیاژ نایتینول را تحت شرایط 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک، 7/1 گرم کلسیم فلوراید (10 دقیقه، دمای محیط) و سپس عملیات شیمیایی با محلول متشکل از اسیدنیتریک 56 درصد، اسیدکلریدریک 37 درصد به نسبت حجمی 1:1 (20 ساعت، در دمای محیط)، نشان می دهد. با بررسی این شکل وجود چین خوردگی و از بین رفتن لایه­های سطحی آلیاژ نایتینول که ناشی از قابلیت خورندگی بالای محلول اسیدی است، مشخص است. همچنین انرژی سطح، تحت این شرایط بسیار بالا است؛ به طوری که ریزحفره­های ایجاد شده تحت اثر محلول اسیدی سه­تائی با عملیات سطحی بعدی از بین رفته و سطح صاف شده است.

شکل 1 : تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سطح نایتینول صیقل­کاری مکانیکی شده و اصلاح شده با a): عملیات A، b) عملیات B،

c): عملیات C، d) عملیات D،e ) عملیات E.

به ­منظور مطالعه بیشتر، علاوه بر میکروسکوپ الکترونی روبشی با استفاده از آنالیز میکروسکوپ نیروی اتمی AFM[1] مورفولوژی سطح مورد ارزیابی قرار گرفت و در این حالت R.M.S و Ra که نشان دهنده زبری سطح هستند با استفاده از این آنالیز محاسبه شدند. شکل
(2-a-e)، تصاویر میکروسکوپ نیروی اتمی از ریخت­شناسی سطح آلیاژ حافظه­دار ناتینیول پولیش و اصلاح سطح شده در دو حالت دو بعدی و سه بعدی نشان می دهد. با بررسی شکل (2-a) مشاهده می‌شود، که سطح آلیاژ نایتینول حاوی خطوط و شیارهایی موازی شکل ناشی از انجام عملیات صیقل­کاری مکانیکی است. به­علاوه، این تصویر نشان می‌دهد اجرای عملیات صیقل­کاری مکانیکی، سطحی با حداقل زبری و فرورفتگی و برجستگی در مقیاس میکرون ایجاد می­نماید. در مقابل، اجرای این عملیات می­تواند سطح را در برخی نواحی دچار کندگی‌های موضعی در کمتر از مقیاس میکرونی نماید. تصویر AFM مربوط به سطح آلیاژ نایتینول پس از قرار گرفتن در محلول اسیدی 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک، در شکل (b-2) معلوم است. بررسی شکل (b-2) نشان می دهد، ریخت­شناسی سطح با انجام عملیات شیمیایی اسیدی دچار تأثیر چندانی نشده است. همچنین خطوط و شیارهای ناشی از عملیات پرداخت سطحی در مرحله قبل از بین رفته و تخلخل­های نامنظم سطحی به صورت محدود ایجاد شده که این امر در تصویر به­خوبی روشن است. با مشاهده شکل (c-2)، سطح تحت تأثیر قرار گرفته و بر روی سطح فرورفتگی و برآمدگی ایجاد شده است. این عامل، زبری سطح را افزایش داده است. شکل (d-2)، نتایج مربوط به ریخت­شناسی سطح آلیاژ نایتینول را در محلول اسیدی سه­تائی به همراه عامل ایجاد کننده گروه های زیستی بر روی سطح (کلسیم فلوراید)، نشان می دهد. تصویر AFM مربوط به این عملیات نشان می­دهد که محلول اسیدی تمرکز خوردگی شدیدی در نواحی داخل حفره­های سطحی داشته است؛ به­ طوری که حفرات بسیار ریزی در کمتر از مقیاس میکرونی بر روی سطح ایجاد شده است. لازم به ذکر است که وجود فلوراید کلسیم پتانسیل خوردگی محلول اسیدی سه­تائی را تحت تأثیر قرار داده است. همچنین حفرات ایجاد شده در اندازه کوچکتری نسبت به عملیات شیمیایی با اسیدنیتریک (شکل (c-2))، حاصل شده­اند. اما این موضوع نشان می دهد که در بعضی از نواحی، سطح تحت تأثیر محلول اسیدی قرار نگرفته است. شکل (2-e)، تصویر میکروسکوپ نیروی اتمی از سطح آلیاژ نایتینول را پس از اصلاح سطح تحت شرایط 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک، 7/1 گرم کلسیم فلوراید (10 دقیقه، دمای محیط) و سپس عملیات شیمیایی با محلول متشکل از اسیدنیتریک 56 درصد، اسیدکلریدریک 37 درصد به نسبت حجمی 1:1 (20 ساعت، در دمای محیط)، نشان می­دهد. این شکل وجود چین خوردگی و از بین رفتن لایه­های سطحی که می­تواند در اثر قابلیت بالای خورندگی محلول اسیدی باشد، آشکار می­کند. این موضوع در مورد تصویر میکروسکوپ الکترونی نیز مشخص بود. پستی و بلندی های سطح در این شرایط بسیار بالا بوده و تمام نقاط سطح آلیاژ تحت تأثیر واقع شده است. همچنین تأثیر اسیدکلریدریک در مرحله عملیات شیمیایی توانسته است که شرایط خوردگی سطح را تغییر دهد. بافت سطح از نظر وجود حفره­ها به شکل نیم­کره و هم اندازه ضعیف می باشد. مورفولوژی ترکیبی از حفره­هایی بسیار ریز و سطوح لایه برداری شده با پستی و بلندی بالا است.  

شکل 2 : تصویر میکروسکوپ نیروی اتمی از سطح نایتینول صیقل­کاری شده و اصلاح شده با a): عملیات A، b) عملیات B، c): عملیات C،

d) عملیات D، e) عملیات E.

نمودار 3-(a-b)، مقادیر میانگین زبری سطح (Ra) و میزان زبری سطح (R.M.S) از سطوح آلیاژ حافظه­دار صیقل­کاری مکانیکی شده و اصلاح شیمیایی شده را نشان می­دهد. در این راستا، بالاترین زبری سطح مربوط به عملیات سطحی مربوط به اجرای عملیات E است. همان­طور که از تصاویر میکروسکوپ نیروی اتمی مشخص است، مورفولوژی سطح آلیاژ حافظه­دار نایتینول با اجرای عملیات E به شکل به هم پیچیده بوده است. به­علاوه، ارتفاع پستی و بلندی­های سطح نیز در این حالت بالاتر از سایر گروه­های دیگر (A-D) می­باشد. گروه C که دارای تخلخل­های منظم بوده (شکل 2-c) و از اسیدنیتریک برای عملیات شیمیایی بعدی استفاده گردیده، زبری سطح کمتری نسبت به گروه E داشته است. اما، زبری سطح گروه C پس از گروه E بالاتر از بقیه گروه­های دیگر عملیات سطحی بوده است. سطح آلیاژ نایتینول صیقل­کاری شده دارای حداقل زبری بود. این امر برای عملیات اصلاح سطح با گروه B نیز صادق است.

نتایج حاصل از رشد و تکثیر سلول در روز سوم (نمودار 4-a) نشان می­دهد، دو نمونه‌ی E و D تفاوت معنی‌داری با گروه نیکل- تیتانیم کنترل داشته‌اند (3n= و 05/0P<). اما، غیر از دو گروه ذکر شده، تفاوت معنی‌داری بین گروه‌های دیگر مشاهده نشده است. اما، پس از شش روز کشت، میزان رشد و تکثیر سلولی بر روی سطوح آلیاژ حافظه­دار نایتینول اصلاح شیمیایی شده اختلاف قابل ملاحظه‌ای را با سطح اصلاح نشده نشان داد.

  نمودار 3 : مقادیر زبری سطح (a): متوسط زبری سطح (Ra) و (b) میزان زبری سطح (R.M.S) از سطوح نایتینول صیقل­کاری مکانیکی شده و اصلاح شیمیایی شده؛ )همه داده­ها بر حسب mean ± Standard Error (n = 3) گزارش شده­اند(.

ارزیابی‌های آماری نشان داد، تفاوت های معنی‌دار بسیار بالایی بین گروه‌های (C، D وE­) با سطح نیکل- تیتانیم اصلاح نشده (A) وجود دارد (3n= ، 001/0P<). همچنین بین گروه‌ B و گروه‌های (C، D وE­)، نیز این تفاوت قابل ملاحظه است اما، سطوح نیکل-تیتانیم اصلاح شده با محلول اسیدی 80 درصد اسید کلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک و سپس عملیات شیمیایی با محلول ترکیبی از اسیدکلریدریک و اسیدنیتریک (E)، به همراه محلول80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسیدفلوئوریدریک، 10 درصد اسیدفسفریک، 7/1 گرم کلسیم فلوراید (D)، علاوه بر تفاوت‌های معنی‌دار با گروه کنترل، تفاوت‌های معنی‌داری نیز با سطوح نیکل-تیتانیم اصلاح شیمیایی شده، داشتند. مطالعه دیاگرام ستونی نشان می­دهد، گروه کنترل در روز ششم نسبت به روز سوم کاهش رشد و تکثیر سلولی را بر روی سطح خود داشته است و سلول‌های استخوان ساز نتوانسته‌اند بر روی سطح رشد و تکثیر یابند. این امر در حالی­ است که تمام سطوح اصلاح شده افزایش رشد و تکثیر را با افزایش زمان نشان می‌دهند. غیر از دو نمونه‌ی E و D که در روز سوم و ششم بالاترین میزان رشد و تکثیر را داشتند، نمونه‌ C در روز ششم نسبت به روز سوم افزایش بیشتری در رشد و تکثیر سلولی بر روی سطح خود نشان داد. به­علاوه، برای دو متغیر میزان زبری سطح Ra و یا RMS و فعالیت حیاتی، آنالیز واریانس دو عاملی انجام شد و مقادیر توصیفی و تحلیلی آن به صورت جدول­ 2 و جدول 3 ارائه شده­ است.

نمودار 4 : فعالیت حیاتی رشد و تکثیر  سلول‌های استخوان‌ساز بر روی سطوح نیکل- تیتانیم اصلاح شده و گروه کنترل پس از a): سه روز کشت و b): شش روز کشت.

جدول 2 : میانگین و انحراف معیار فعالیت حیاتی و با متغیر میزان زبری سطح (Ra و یا RMS) بر حسب مدت زمان و گروه

نتایج چسبندگی سلولی (نمودار 5)، نشان می‌دهد، دو نمونه‌ (C) و (E) بالاترین میزان چسبندگی سلول را به سطح خود داشته‌اند. اما، نمونه‌هایی که بالاترین میزان زبری را داشته‌اند (نمونه‌هایی که با محلول 80 درصد اسیدکلریدریک، 10 درصد اسید فلوئوریدریک، 10 درصد اسید فسفریک اصلاح شده‌اند و سپس از اسیدنیتریک به عنوان عملیات بعدی استفاده شده­اند)، نسبت به سایر نمونه‌ها میزان چسبندگی بالاتری را نشان داده‌اند. در نمونه (E) که بیشترین زبری را در مقیاس نانو داشت، این میزان حداکثر و برای نمونه‌ی (C) نیز این مقدار بالا بود. ملاحظات آماری تفاوت قابل توجهی را بین نمونه‌ (E) و گروه کنترل نشان داد (3n= و 001/0P<). تفاوت معنی‌داری نیز بین نمونه‌ (C) و نمونه (B) و همچنین نمونه (E) و نمونه (A) وجود داشت (3n= و 001/0P<). همچنین ملاحظات آماری تفاوت قابل توجهی را بین نمونه‌ (C) و گروه (B) نشان داد ( 3n= و01/0P<).

جدول 3 : مقادیر میانگین و انحراف استاندارد عملیات های سطحی برای چسبندگی سلول

نمودار 5 : تعداد سلول‌های استخوان ساز چسبیده بر روی سطوح نیکل- تیتانیم اصلاح شده و گروه کنترل پس از 16 ساعت کشت.