نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار گروه آسیب شناسی دهان، فک و صورت دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی بابل
2 استادیار گروه آسیب شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی بابل
3 دندانپزشک
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: The aim of this survey was immunohistochemical evaluation of MIB-1 expression in dental follicle and dentigerous cyst regarding to the capability of neoplastic changes and ability for more proliferation and more recurrence after enucleation in dentigerous cysts.
Materials & Methods: Sections taken from paraffined block of 12 cases of dentigerous cyst and 12 cases of dental follicle were stained with MIB-1antibody, using immunohistochemical method. The observing of all of the stained sections was done according to Hscore gradation and a degree of staining intensity of epithelial cells and the percent of stained epithelial cells were considered. Then the aggregate these two were announced as the final score. The data were analyzed by Mann-Whitney test.
Results: The expression of MIB-1 in dentigerous cyst was greater than dental follicle (P<0.001). This difference was significant for the percentage of stained epithelial cells (P=0.001) and it was greater in dentigerous cyst.
Conclusion: The expression of MIB-1 in dentigerous cyst was greater than dental follicle. This difference may are attributed to the capability of neoplastic changes and ability of proliferation in epithelium layer of dentigerous cyst and different clinical behavior of dentigerous cyst.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
فولیکول دندانی که از اکتومزانشیم ادنتوژنیک به وجود میآید، یکی از اجزای جوانه دندانی می باشد که به طور فیزیولوژیک تبدیل به سمنتوم، لیگامنت پریودنتال و استخوان آلوئول می شود.(2و1) در رادیوگرافی، به عرض کمتر از 3
میلی متر در اطراف دندان رویش نیافته یا نهفته دیده می شود. فولیکول دندانی مرتبط با دندان نهفته از نظر هیستولوژیکی، بافت همبند فیبروزه را همراه با اپی تلیوم کاهش یافته مینایی نشان می دهد.(3)
کیست دنتی ژروس، کیستی است که از جدا شدن فولیکول دندان از اطراف تاج یک دندان رویش نیافته منشاء می گیرد. این کیست، شایع ترین کیست رشدی تکاملی ادنتوژنیک است و حدود 20% کل کیست های مفروش با اپیتلیوم فکین را شامل می شود.(5و4)
کیست دنتی ژروس، تاج یک دندان رویش نیافته را در برمی گیرد و در ناحیه اتصال سمان به مینا (CEJ) به دندان متصل می گردد. پاتوژنز این کیست نامشخص است، اگرچه این کیست ها به همراه دندان های رویش نیافته ایجاد میشوند ولی تخمین زده می شود که فقط در یک درصد این دندان ها، کیست ایجاد می گردد. بنابراین عوامل ناشناخته دیگری نیز در ایجاد آن دخیل می باشند.(6) از نظر رادیوگرافیکی، کیست دنتی ژروس به طور مشخص به صورت یک ناحیه رادیولوسنت تک حفره ای همراه با تاج یک دندان رویشنیافته می باشد.(9-7) گرچه ممکن است کیست دنتیژروس در بیماران با طیف سنی وسیع دیده شود ولی اغلب در سنین 30-10 سال یافت می شود. درگیری جنس مذکر به مونث در این ضایعه 6:1/1 است.(10و8و7) شیوع آن در سفیدپوستان بیشتر از سیاه پوستان می باشد.(9-7) پوشش اپیتلیایی کیست، 4-2 ردیف از سلول های مسطح غیرکراتینیزه است.(13-11و7) کیست دنتی ژروس درمان نشده باید مهم در نظر گرفتـه شـود. ممکن است لایـه اپـی تلیـالی کیست دنتی ژروس به آملوبلاستوما تبدیل شود. تغییرات کارسینوماتوز (پدید آمدن کارسینوم سلول سنگفرشی) هم در اپی تلیوم کیست ممکن است قابل توجه باشد که به ندرت ایجاد می شود. در نمونههایی که در آنها سلول های موکوسی وجود دارد پتانسیل پیشرفت به موکو اپی درموئید کارسینومای داخل استخوانی وجود دارد.(14و8و7)
به طور کلی روش های متفاوتی در بررسی بیان پروتئینهای مختلف در ضایعات و تومورهای فکی بکار رفته است. از جملة این تکنیک ها، کاربرد ایمونوهیستوشیمی میباشد. با استـفاده از ایمونوهیستوشیمی، میتوان نشانگرهای موثر در تعیین پیشرفت و حالت تهاجمی و پیش آگهی ضایعات مختلف را بررسی کرد. یکی از این نشانگرها، آنتیژن 67Ki- می باشد.(15)
آنتی ژن 67Ki- یک پروتئین غیرهیستونی 395 کیلو دالتونی است که توسط یک ژن در روی کروموزوم 10 کد میشود. این آنتی ژن در سلول های در حال تکثیر در مرحله سنتز DNA بارز می شود و بلافاصله بعد از میتوز از بین میرود. نشانگر 67Ki- یک مارکر سلولی برای تکثیر است که به طور مستقیم وابسته به تکثیر سلول می باشد. آنتی ژن 67Ki- در طی اینترفاز، در هسته سلول به مقدار خیلی زیاد دیده می شود در حالی که در طی میتوز اغلب پروتئین ها در سطح کروموزوم ها قرار می گیرند. پروتئین 67Ki- در طی همه فازهای فعال چرخه سلولی (G2، G1، S و میتوز) موجود است اما در فاز استراحت G0)) حضور ندارد.(18-16)
اولین بار در سال 1983 آنتی بادی منوکلونال موشی علیه این آنتی ژن به عنوان یک آنتی ژن هسته ای در سلول های Reed-Sternberg لنفوم هوچکین معرفی گردید.(19) سه نوع آنتی بادی بر علیه آنتی ژن 67Ki- گزارش شده است:
Monoclonal Ki-67 antibody، MIB-1 antibody،
Polyclonal Ki-67 antibody.(20)
MIB-1 یک آنتی بادی منو کلونال رایج است که آنتی ژن 67Ki- را مشخص میکند و در کاربردهای کلینیکی جهت نشان دادن 67Ki- به کار می رود. یکی از مزایای اولیه آن نسبت به آنتی بادی 67Ki- اولیه (و علت این که چرا می تواند جایگزین آنتی بادی اولیه شود) این است که می تواند در بلوک های پارافینه نمونه های ثابت شده با فرمالین بعد از بازیافت آنتی ژن حرارت داده شده، استفاده شود.(16) امروزه ثابت شده که آنتی بادیMIB-1 ، به عنوان آنتی بادی منوکلونال موشی، مرجعی برای تشریح آنتی ژن 67Ki- میباشد که یک آنتی ژن هسته ای است و در تمام سلول های تکثیرشونده انسانی وجود دارد.(18و17)
از آن جایی که کیست دنتی ژروس از فولیکول دندانی تغییر یافته و جدا شده از تاج دندان نهفته به وجود می آید انتظار می رود که بیان پروتئین 67Ki- در کیست دنتی ژروس که گاهی قابلیت ایجاد تغییرات نئوپلاستیک در جدار این کیست وجود دارد و از طرفی رفتار بالینی متفاوت و عود بعد از برداشت بیشتری نسبت به فولیکول دندانی دارد، متفاوت از آن باشد. این تحقیق با هدف بررسی بیان MIB-1 توسط روش ایمـونـوهیستـوشیـمی در میان کیـست های دنتـی ژروس و فولیکول های اطراف دندان های نهفته انجام شد.
مواد و روش ها
دراین مطالعه تحلیلی- توصیفی، تعداد 12 مورد کیست دنتی ژروس به دست آمده از بایگانی بخش پاتولوژی دهان و فک و صورت دانشکده دندانپزشکی بابل (مربوط به 12 بیمار، 5 مونث و 7 مذکر با میانگین سنی 22/6±66/25) و 12 مورد فولیکول دندانی به دست آمده از جراحی دندان های عقل نهفته افرادی که به منظور فوق به بخش جراحی دانشکدۀ دندانپزشکی بابل مراجعه کرده بودند (مربوط به 12 بیمار، 8 مونث و 4 مذکر با میانگین سنی 12/3±86/22)، انتخاب شد.
بلوک های مربوطه از بایگانی خارج و اطلاعات بالینی (سن، جنس، محل ضایعه) از پرونده های بیماران استخراج شد. آنگاه از هر بلوک، برش 5 میکرونی تهیه و با روش هماتوکسیلین وائوزین رنگ آمیزی شده و مجدداً مورد ارزیابی قرار گرفت. بلوک های مناسب محتوی حداکثر طول اپی تلیوم پوشاننده کیست و فولیکول، انتخاب و از هر یک برش 3 میکرونی تهیه گردید. برش های مذکور به منظور پارافینزدایی، 24-18 ساعت در فور ˚C37 و سپس 20 دقیقه در فور با دمای ˚C80 قرارگرفتند. سپس برش ها به منظور آبگیری به ترتیب در داخل 2 ظرف الکل مطلق 100%، 1 ظرف الکل 96%، 1 ظرف الکل 80% و 1 ظرف الکل 70% به مدت 3-2 دقیقه قرار داده شد. برش ها پس از پارافین زدایی و آبگیری به مدت 15 دقیقه با محلول Citrate/Hcl Buffer 10 mmol در اتوکلاو انکوبه شدند تا بازیابی آنتی ژن صورت گیرد. این برش ها با استفاده از کمپلکس استرپتوآویدین بیوتین رنگآمیزی شدند. سپس درTBS[1] غوطه ور شده، در مرحله بعد به مدت 15 دقیقه با آنتی بادی MIB-1[2] در درجه حرارت محیط انکوبه شدند. بعد از آن با TBS شسته شده، با بیوتین به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند. نمونه ها بار دیگر در TBS شسته شده، سپس استرپتوآویدین به مدت 15 دقیقه روی لامها قرار گرفت. بعد از شستشوی مجدد در TBS و DAB[3] به عنوان کروموژن به مدت 10 دقیقه به کار برده شد. سپس رنگآمیزی زمینه ای (Counter staining) هماتوکسیلین مایر بر روی اسلایدها به کار رفته و بعد از دهیدراته کردن، لامل چسبانیده شد.
تمامی اسلایدهای رنگ آمیزی شده توسط پاتولوژیست با میکروسکوپ نوری Olympus مدل BX41 با بزرگنمایی 400× مشاهده شد. در این بررسی از نمونه آدنوکارسینوم پستان به عنوان کنترل مثبت و از سرم غیرایمونیزه موش با حذف آنتیبادی اولیه به عنوان کنترل منفی، استفاده شد.
برای هر لام براساس درجه بندی Hscore، درجه ای از شدت رنگ پذیری سلول های اپیتلیالی و درصد سلول های رنگ گرفته در اپی تلیوم پوشاننده فولیکول دندانی و کیست دنتی ژروس در نظر گرفته شد. سپس مجموع این دو به عنوان Score نهایی بیان شد.(21)
در ارتباط با شدت رنگ آمیزی: در صورت عدم رنگآمیزی عدد 0، رنگ آمیزی ضعیف (قهوه ای کم رنگ) عدد 1، رنگ آمیزی متوسط (قهوه ای) عدد 2 و رنگ آمیزی شدید (قهوه ای تیره) عدد 3 در نظر گرفته شد.
در ارتباط با تعداد سلول های رنگ گرفته: اگر تعداد سلولهای رنگ گرفته، کمتر از 1% کل سلول های اپیتلیالی بود، 1Score، بین 1% تا 10% کل سلول های اپیتلیالی، 2Score، بین 11% تا 33% کل سلول های اپیتلیالی، 3Score، بین 34% تا 66% کل سلول های اپیتلیالی، 4Score و اگر تعداد سلولهای رنگ گرفته، بین 67% تا 100% کل سلول های اپیتلیالی بود 5Score، در نظر گرفته شد.(21)
اطلاعات بدست آمده با استفاده از آزمون
Exact Mann-Whitney مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و 05/0>P معنی دار در نظر گرفته شد.
یافته ها
در مطالعة حاضر، نتیجة رنگ آمیزی ایمـونـوهیستـوشیمیـایی جـهت بررسـی MIB-1 در کیست دنتی ژروس و فولیکول دندانی مورد بررسی قرار گرفت (تصاویر 1و2).
تصویر 1 : بیان MIB-1 در فولیکول دندانی (رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی، 400×)
تصویر 2 : بیان MIB-1 در کیست دنتی ژروس (رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی، 400×)
نتیجه رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی جهت MIB-1 در کیست دنتی ژروس و فولیکول دندانی بر اساس درصد سلولهای اپیتلیالی رنگ گرفته، شدت رنگ پذیری سلولهای اپی تلیالی و براساس Score نهایی (مجموع درصد سلولهای اپیتلیالی رنگ گرفته و شدت رنگ پذیری سلولهای اپی تلیالی) به ترتیب در جداول 1، 2و 3 آمده است.
در 9 مورد (75%) کیست دنتی ژروس، شدت رنگپذیری، متوسط و در 8 مورد (6/66%) فولیکول دندانی شدت رنگپذیری، ضعیف بود که حداکثر موارد را به خود اختصاص داد.
جدول 1 : توزیع فراوانی نتیجه رنگ آمیزی با MIB-1 (بر اساس درصد سلول های اپیتلیالی رنگ گرفته)
|
نوع نمونه |
تعداد نمونه |
1Score |
2Score |
3Score |
4Score |
5Score |
|
کیست دنتی ژروس |
12 |
0(0%) |
0(0%) |
1(3/8%) |
8(6/66%) |
3(25%) |
|
فولیکول دندانی |
12 |
4(3/33%) |
1(3/8%) |
4(3/33%) |
3(25%) |
0(0%) |
001/0=P
جدول 2 : توزیع فراوانی نتیجه رنگ آمیزی با MIB-1 (بر اساس شدت رنگ پذیری سلول های اپیتلیالی)
|
نوع نمونه |
تعداد نمونه |
عدم رنگ آمیزی 0=Score |
ضعیف (قهوه ای کمرنگ) 1= Score |
متوسط (قهوه ای) 2= Score |
شدید (قهوه ای تیره) 3= Score |
|
کیست دنتی ژروس |
12 |
0(0%) |
3(25%) |
9(75%) |
0(0%) |
|
فولیکول دندانی |
12 |
0(0%) |
8(6/66%) |
4(3/33%) |
0(0%) |
089/0P=
جدول 3 : توزیع فراوانی نتیجه رنگ آمیزی با MIB-1 (بر اساس Score نهایی: شدت رنگ پذیری سلول های اپیتلیالی+ درصد سلول های اپیتلیالی رنگ گرفته)
|
نوع نمونه |
تعداد نمونه |
Score 1 |
Score 2 |
Score 3 |
Score 4 |
Score 5 |
Score 6 |
Score 7 |
Score 8 |
|
کیست دنتی ژروس |
12 |
(0%)0 |
(0%)0 |
(0%)0 |
(3/8%)1 |
1(3/8%) |
(6/66%)8 |
2(6/16%) |
0(0%) |
|
فولیکول دندانی |
12 |
(0%)0 |
4(3/33%) |
1(3/8%) |
(3/8%)1 |
5(6/41%) |
(3/8%)1 |
(0%)0 |
(0%)0 |
P<001/0
طبق بررسی های آماری انجام گرفته تفاوت بین دو گروه کیست دنتی ژروس و فولیکول دندانی از نظر بیان MIB-1 قابل ملاحظه و معنی دار بود (001/0P<) و بیان آن در کیستهای دنتی ژروس بیشتر از فولیکول دندانی بوده است (جدول 3). این اختلاف در ارتباط با درصد سلول های اپیتلیالی رنگ گرفته با MIB-1 معنی دار بدست آمد و میزان آن در کیست دنتی ژروس بیش از فولیکول دندانی بود (001/0P=) (جدول 1). همچنین محل بروز نشانگر در نواحی بازال-پارابازال بود.
بحث
دندان های مولر سوم و ضایعات مربوط به آن یکی از دلایل بسیار شایع مراجعه بیماران به جراحان فک و صورت است. یکی از شایعترین ضایعات مرتبط با دندان های مولر سوم، کیست دنتی ژروس می باشد. در این مطالعه فولیکول دندانی همراه با دندان مولر سوم رویش نیافته با کیست دنتیژروس که از فولیکول دندانی تغییریافته و جدا شده از تاج دندان رویش نیافته به وجود می آید، از نظر بیان MIB-1 مقایسه گردید.(1)
در مطالعه حاضر دیده شد که بیان MIB-1 در کیست دنتیژروس به طور قابل ملاحظه ای بیشتر از فولیکول دندانی است و با توجه به اینکه MIB-1 یک مارکر سلولی برای تکثیر است که به طور مستقیم وابسته به میزان تکثیر سلولی میباشد، به نظر می رسد بیان بیشتر این پروتئین در کیست دنتی ژروس را بتوان به میزان توانایی تکثیر بیشتر اپی تلیوم این کیست در مقایسه با فولیکول دندانی نسبت داد.
67Ki- یک آنتی ژن هسته ای است که در همه فازهای فعال سیکل سلولی (M, G2, S, G1) وجود دارد ولی درG0 حضور نمی یابد. این آنتی ژن ممکن است توسط یکی از سه نوع آنتی بادی Monoclonal Ki-67،Polyclonal Ki-67 و
MIB-1 بررسی شود. Monoclonal Ki-67 تنها در نمونه بافتی Frozen و تازه قابل بررسی میباشد که یک محدودیت مهم به حساب می آید. دو آنتی بادی Polyclonal و MIB-1 بر علیه پپتیدال قطعات Recombinant ژن مربوط به آنتی ژن 67Ki- تکامل یافته اند. این دو آنتی بادی به طور مرسوم جهت بررسی تکثیر سلولی به کار میروند و با هم قابل مقایسه هستند. بیان MIB-1 یک مارکر قابل اعتماد در تکثیر سلول است(22و18-16) که در مطالعه ما در سلول های اپیتلیالی در فولیکول دندانی و کیست های دنتی ژروس دیده شد و میزان بیان آن در کیست دنتی ژروس بیش از فولیکول دندانی بود.
در مطالعه Saracoglu و همکاران با روش ایمونوهیستوشیمی، بیان 67Ki- در بقایای اپی تلیوم ادنتوژنیک، اپی تلیوم نرمال مخاط دهان و اپی تلیوم کیستهای ادنتوژنیک مورد ارزیابی قرار گرفت و بیان این مارکر در بقایای اپیتلیالی ادنتوژنیک، اپی تلیوم نرمال مخاط دهان و کیست های رادیکولار و دنتی ژروس مشابه بدست آمد. همچنین بیشترین میزان رنگ پذیری در اپی تلیوم کراتوسیستیک ادنتوژنیک تومور (KCOT) دیده شد. در این مطالعه سرعت رشد پوشش اپیتلیالی انواع مختلف کیستهای ادنتوژنیک، متفاوت به نظر می رسید. KCOT که رفتار تهاجمی آن شناخته شده است، به طور قابل ملاحظه ای تعداد سلول های MIB-1 مثبت بیشتری نسبت به پوشش کیست های ادنتوژنیک دیگر داشت.(24) این مطالعه بنوعی تائیدی بر بررسی ما می باشد که سلول های MIB-1 مثبت در کیست دنتی ژروس بطور قابل ملاحظه ای بیش از فولیکول دندانی بود.
Edamatsu و همکاران به بررسی فاکتورهای مرتبط با آپوپتوز و تکثیر سلولی در اجزای اپی تلیالی فولیکول دندانی و کیست دنتی ژروس همراه با مولر سوم نهفته مندیبل پرداختند و نتیجه گرفتند که کیست های دنتی ژروس نسبت به فولیکول دندانی 67-Ki بیشتری را نشان می دهند(1) که با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد.
در مطالعهای که اسلامی و همکاران انجام دادند نیز نشانگر
67-Ki در آملوبلاستومای تک حجره ای و کیست دنتیژروس با استفاده از روش رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی بررسی شد. میانگین 67-Ki در لایه بازال کیست دنتی ژروس و آملوبلاستومای تک حجره ای تفاوت معنی داری نشان نداد اما در ناحیه سوپرا بازال در آملوبلاستومای تک حجره ای به طور معنی داری بیشتر از کیست دنتی ژروس بود. میانگین تعداد سلول های 67-Ki مثبت در اپی تلیوم پوشاننده آملوبلاستومای تک حجره ای بیشتر از کیست دنتی ژروس بود. بنابراین نتیجه شد که استفاده از 67-Ki در ناحیه سوپرا بازال در مقایسه با کل ضخامت اپی تلیوم پوشاننده در دو ضایعه، می تواند به عنوان شاخصی برای تشخیص کیست دنتی ژروس از آملوبلاستومای تک حجره ای مورد استفاده قرار گیرد. از آنجایی که کیست دنتی ژروس یک پاتوز محسوب می شود، طبیعی است که تکثیر بیشتر سلولی در آن مشاهده شود. آنچه مسلم است حضور نشانگر 67-Ki به عنوان شاخص تکثیر بر سلول های بازال حکایت از فعالیت تکثیری در این ناحیه از اپی تلیوم دارد که دور از انتظار هم نمی باشد. همچنین حضور بیشتر این نشانگر در ناحیه سلول های پارابازال کیست دنتی ژروس تمایل بیشتر آن را برای ایجاد تغییرات نئوپلاستیک نسبت به فولیکول دندانی نشان می دهد. این نشانگر در قسمت های سطحی اپی تلیوم که دارای تمایز بیشتری می باشد کمتر بیان می شود زیرا تمایز و فعالیت تکثیری نسبت یکدیگر رابطه عکس دارند و هر چه بافت
تمایز یافته تر باشد، قدرت تکثیر کمتری خواهد داشت.(20)
نتایج حاصل از بررسی حاضر حاکی از بالاتر بودن میزان تکثیر سلولی در اپی تلیوم پوشاننده کیست دنتی ژروس نسبت به فولیکول دندانی بود که با نتایج مطالعه اسلامی و همکاران قابل مقایسه می باشد.
نتیجه گیری
بیان MIB-1 در کیست دنتی ژروس بیشتر از فولیکول دندانی بود (001/0P<) که به نظر می رسد این تفاوت ناشی از استعداد ایجاد تغییرات نئوپلاستیک در جدار کیست و میزان فعالیت تکثیری بالای آن و عود بیشتری بعد از برداشت نسبت به فولیکول دندانی است. این ارتباط راجع به درصد سلولهای رنگ گرفته با MIB-1(001/0P=) مفیدتر از شدت رنگ پذیری بوده است (089/0P=).
تشکر و قدردانی
از مساعدت معاونت محترم تحقیقات و فناوری و مرکز تحقیقات دانشگاه علوم پزشکی بابل در انجام این مطالعه، قدردانی بعمل می آید. همچنین از آقای دکتر علی بیژنی که در تجزیه و تحلیل آماری این مقاله همکاری نمودند، قدردانی می گردد.
)