Comparison of the Anti-caries Effect of Polyphenol Extract of Green Tea with 0.05% Fluoride, 0.2% Cholorhexidine and Fluoride-Cholorhexidine, An In Vitro Study

Document Type : original article

Authors

1 Assistant Professor of Operative Dentistry, Dental Research Center, School of Dentistry, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran

2 Assistant Professor of Oral Medicine, School of Dentistry, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran

3 Associated Professor of Oral Medicine, Dental Research Center, School of Dentistry, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran

4 Associated Professor of Operative Dentistry, Dental Research Center, School of Dentistry, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran

5 Assistant Professor of Microbiology, School of Medicine, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran

6 Assistant Professor of Community Medicine, School of Medicine, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran

7 Dentist

Abstract

Introduction: Mouth rinses beside the other methods have an important role in reducing dental caries. The aim of this study was in-vitro comparison of the anti-caries effect of polyphenol extract of green tea with 0.05% fluoride, 0.2% cholorhexidine and fluoride-cholorhexidine.
Materials & Methods: In this laboratory experimental study, 50 maxillary premolars were placed separately in tubes which contained cariogenic solution (streptococcus mutans, lactobacillus and 3 ml sucrose solution of 20%). Each tube regarding the rinse solution was placed in 5 experimental groups (n=10) as follows: 1) normal saline, 2) 10% solution of green tea polyphenol extract, 3) 0.05% fluoride, 4) 0.2% cholorhexidine and 5) fluoride_cholorhexidine. Every 24 hours, the teeth were rinsed with 5 mL of the rinse. After 21 hours, the depth of decay was measured by polarized light microscope. Data were analyzed by SPSS V 13.0 software using Colmogrove Smirnove, One way ANOVA and Tukey tests.
Results: The mean and standard deviation of the depth of the caries in group 1 to 5 were 194 ±16.43, 175±17.94, 142±9.34, 155±13.27, and 144±8.57, respectively. One way ANOVA showed that there were significant differences between the groups (P<0.001). Tukey test showed that although there was no significant difference in the depth of the caries between groups 1 and 2 (P=0.205), it was significantly less than groups 3 to 5 (P<0.001). There were no significant differences between the depth of the caries in group 3, 4 and 5.
Conclusion: According to the results of the current study, the anti-caries effect of flouride_cholorhexidine was the greatest between the groups. As the anti cariogenic effect of green tea was similar to that of normal saline and significantly less than fluoride or chlorhexidine, its use as a common mouth rinse needs more research.

Keywords


مقدمه

پوسیدگی دندان شایع‏ترین بیماری مزمن در جهان و یک بیماری عفونی ناشی از کلونیزاسیون باکتری‏ها است که با دکلسیفیکاسیون بخش غیرآلی دندان شروع شده و با تخریب ماتریکس آلی دنبال می‌شود. با وجود آن که امروزه از میزان و شدت آن بسیار کاسته شده است، ولی هنوز میلیون‌ها کودک و بزرگسال، پوسیدگی، از دست دادن دندان و مال‏اکلوژن را تجربه می‌کنند.(1) در ایران نیز علیرغم فعالیت‏های گسترده در زمینه پیشگیری و کنترل پوسیدگی مطالعات نشان داده است که این عارضه هنوز از شیوع بالایی برخوردار است.(4-2) دهانشویه‌ها به عنوان ابزار کمکی و در کنار روش‌های مکانیکی مثل مسواک زدن و استفاده از نخ دندان، در کاهش میزان باکتری‌های دهان از جمله استرپتوکوک موتانس و در نتیجه کاهش پوسیدگی نقش مهمی دارند.(5) یک دهانشویه مطلوب علاوه بر طیف ضدمیکروبی بایستی دارای مقاومت دارویی کمی بوده و در عین حال کمتر موجب از بین رفتن میکروفلور طبیعی دهان گردد(6) در مطالعات گوناگون تاثیر دهان شویه‌های مختلف از جمله فلوراید و کلرهگزیدین در کاهش تعداد باکتری‌های پلاک دندانی از جمله استرپتوکوک موتانس و پیشگیری از پوسیدگی به اثبات رسیده است.(7) به عنوان مثال نشان داده شده است دهانشویه فلوراید که اولین بار در دهه 1950 معرفی شد و اثر ضدپوسیدگی آن در تعداد زیادی از تحقیقات کلینیکی مطالعه شده است، سبب 35 درصد کاهش پوسیدگی به دنبال استفاده هفتگی یا روزانه می‌شود.(8)

چای به عنوان یکی از پرمصرف‏ترین نوشیدنی‌ها در سراسر جهان و به ویژه در ایران حاوی پلی‏فنول‏ها، کافئین، فلاوونول‌ها، تئین و ترکیبات معطر است.(9) به طور کلی پلی‏فنول‌های گیاهی ترکیباتی هستند که می‌توانند پروتئین‌ها را رسوب دهند.(10) از جمله پلی‏فنول‌های چای سبز فلاوین و تیرابیجین است. خواص ضدباکتریایی پلی‏فنول‌های چای سبز نیز نشان داده شده است و دانشمندان نشان داده‏اند که پلی‏فنول‌های برگ سبز چای اثر مهاری بر رشد اشرشیاکلی، استرپتوکوک پیوژنز و استافیلوکوک اورئوس دارد.(11) در سال 2004 محققان دریافتند که پلی‏فنول‌های چای قادر به مهار استرپتوکوک موتانس می‌باشد.(10)

با توجه به اثر پلی فنل‏های چای سبز در مهار استرپتوکوکوس موتانس و هم چنین اثر قطعی استرپتوکوکوس موتانس موجود در پلاک باکتریائی در بروز پوسیدگی، استفاده از این نوشیدنی رایج به عنوان یک دهانشویه ضدپوسیدگی می‏تواند مورد بررسی قرار گیرد و از آن جایی که طبق جستجوی ما تاکنون مطالعه‏ای در جهت مقایسه اثر ضدپوسیدگی چای سبز نسبت به دهانشویه‌های رایج در بازار ایران، در کشور ما انجام نشده است انجام چنین تحقیقی ضروری به نظر می‏رسد. هدف از این مطالعه، مقایسه اثر ضدپوسیدگی عصاره پلی‏فنول چای سبز با دهانشویه فلوراید 05/0%، کلرهگزیدین 2/0% و ترکیب فلوراید-کلرهگزیدین در محیط آزمایشگاه بود.

مواد و روش‏ها

در این مطالعه تجربی-آزمایشگاهی، 50 دندان پرمولر فک بالای تازه کشیده شده (حداکثر 3 ماه) سالم انسانی که فاقد پوسیدگی، ترک یا ترمیم قبلی بودند و سطح مینای بدون نقصی (ارزیابی چشمی با استفاده از ذره‏بین با بزرگنمایی 4 برابر) داشتند، انتخاب و به صورت تصادفی در 5 گروه آزمایشی قرار گرفتند (10=n).

گروه اول(کنترل) شستشو با سالین نرمال (DarouPakhsh Co. Tehran, Iran)

گروه دوم شـستشو با مـحلول 10% عـصاره پـلی‏فنول چای سبز (Co., Tehran, IranGulf Supplements)

گروه سوم شستشو با فلوراید 05/0% (Namjou Pharmacology Co., Tehran, Iran)

گروه چهارم شستشو با کلرهگزیدین 2/0 درصد (Namjou Pharmacology Co., Tehran, Iran)

گروه پنجم شستشو با ترکیب کلر هگزیدین 2/0% و فلوراید 05/0% که به نسبت 1 به 1 با هم ترکیب شدند.

دندان‌ها بلافاصله بعد از کشیده شدن در محلول نرمال سالین 9/0% (DarouPakhsh Co. Tehran, Iran) قرار داده شدند و سپس به منظور ضدعفونی شدن یک هفته در محلول فرمالین 10% (DarouPakhsh Co. Tehran, Iran)نگهداری شدند.(12) پس از گذشت یک هفته، باقی مانده بافت نرم دندان‌ها توسط کورت پریودنتال (Juya, Keshmir, Pakestan) برداشته شد و دندان‌ها با پامیس (Golchadent Co. Karaj, Iran) بدون فلوراید و رابرکپ (Kerr, California, USA) تمیز شدند. همه قسمت‌های دندان به جز مربعی به ابعاد 3×3 میلی‏متر روی سطح باکال با لاک پوشانده شد، سپس دندان‏ها درون اتوکلاو (Farazmehr, Tehran, Iran)در دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 15 پوند برای 15 دقیقه استریل شدند. سپس اپکس دندان‌ها با موم چسبی (Azar teb Co, Tabriz, Iran) که توسط تابش اشعه UV (Jaltajhiz Co., Karaj, Iran) به مدت 2 ساعت از فاصله 30 سانتی‏متری استریل شده بود، سیل شد. محیط کشت (BHI-Broth)Brain-heart infusion broth  (Merck Co., Frankfort, Germany) تهیه شد و توسط اتوکلاو استریل شد. دندان‏های آماده شده به صورت مجزا درون یک لوله آزمایش حاوی 5 میلی‏لیتر محیط کشت BHI-Broth قرار داده شدند و برای 24 ساعت درون انکوباتور (Thel Co., Chicago, USA) در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفتند. بعد از این مدت به منظور اطمینان از عدم حضور آلودگی، لوله‌ها از نظر کدورت به صورت چشمی بررسی شدند. بعد از اطمینان از عدم آلودگی لوله‏ها، 108×5/1 سلول استرپتوکوک موتانس (معادل 5/0 مک فارلند) و 108×5/1 لاکتوباسیل (معادل 5/0 مک فارلند) با 3 میلی‏لیتر محلول سوکروز 20 % به هر لوله اضافه شد. در طی 21 روز، دندان‏ها هر 24 ساعت از محلول‏ها خارج می شدند. با 5 میلی‏لیتر از محلول‌های مورد آزمایش با استفاده از سرنگ با فشار ملایم، از فاصله 5 سانتی‏متری توسط یک نفر شستشو داده می‌شدند.

لازم به توضیح است عصاره 10% پلی‏فنول چای سبز با حل کردن 10 گرم عصاره پلی‏فنول چای سبز در 100 میلی‏لیتر محلول دی متیل سولفوکساید DMSO (Sigma Aldrich, St Louis, USA) تهیه شد.(13)

یک روز در میان 2 میلی‏لیتر از محلول خارج می‌شد و برای اطمینان از عدم آلودگی با سایر باکتری‌ها در محیط کشت آگار کشت داده می‌شد و 2 میلی‏لیتر محلول جدید (حاوی محیط کشت و محلول گلوکز) جایگرین می‌شد. پس از طی دوره 21 روزه، دندان‌ها از محلول خارج ‌شد و برای بررسی عمق دمینرالیزاسیون به صورت زیر آماده‏سازی ‌شد. لازم به ذکر است که از این مرحله به بعد آزمایش به صورت Blindانجام شد و آزمایشگر از نوع محلول استفاده شده، آگاهی نداشت.

بعد از شستشو با آب مقطر با استفاده از دستگاه میکروتوم مدل DS4055 (Dide Sabz, Uromieh, Iran)، دندان‌ها در امتداد محور باکولینگوالی، به نحوی که برش از راس کاسپ عبور کند، به دو نیمه تقسیم ‌شدند و سپس از هر نیمه دو برش با ضخامت 300 میکرومتر تهیه ‌شد. برش‏های تهیه شده برای ارزیابی عمق پوسیدگی توسط میکروسکوپ پلاریزه BX51-P (Olympus, Tokyo, Japan)، زیر نور پلاریزه در آب با ضریب شکست 33/1 قرار گرفتند و بیشترین عمق دمینرالیزاسیون برای هر دندان بر اساس میکرومتر ثبت ‌شد (تصویر 1). داده‌ها به وسیله نرم‌افزار SPSS با ویرایش 13 مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. پس از اثبات نرمال بودن داده ها توسط آزمون Kolmogrov-smirnov لذا جهت مقایسه میانگین پوسیدگی در گروه‌های مختلف از آنالیز واریانس یک‏سویه و تست تکمیلی توکی در سطح معنی‌داری 05/0 استفاده شد.

یافته‌ها

مقدار حداکثر، حداقل، میانگین و انحراف معیار عمق پوسیدگی نمونه‏ها بر حسب گروه آزمایشی در جدول 1 آورده شده است. نمودار 1 توزیع عمق پوسیدگی در گروه‏های آزمایشی مختلف را نشان می‏دهد. آنالیز واریانس یک سویه نشان داد که بین گروه‏های آزمایشی تفاوت معنی‏داری از لحاظ عمق پوسیدگی وجود دارد (001/0P<). نتایج آزمون تکمیلی توکی که در جدول 2 آورده شده است نشان می‏دهد که هرچند عمق پوسیدگی در گروه‏های 1 و 2 تفاوت معنی‏ داری نداشت (205/0=P) ولیکن به صورت معنی‏داری بیشتر از گروه‏های 3 تا 5 بود (001/0>P). عمق پوسیدگی در گروه‏های 3، 4 و 5 نیز تفاوت معنی‏داری نشان نداد.

 

تصویر 1 : نمای پوسیدگی دندان زیر میکروسکوپ نور پلاریزه

 

جدول 1 : عمق پوسیدگی دندان‌های گروه‏های آزمایشی مختلف بر حسب میکرومتر

محلول‏ها شستشودهنده

میانگین

(µm)

حداقل

(µm)

حداکثر

(µm)

انحراف معیار

نرمال سالین

194

00/165

00/213

43/16

چای سبز

175

00/130

00/195

94/17

فلوراید

142

00/131

00/156

34/9

کلرهگزیدین

155

00/130

00/181

27/13

فلوراید- کلرهگزیدین

144

00/129

00/157

57/8

کل

162

155

169

82/23

 

 

 

نمودار 1 : مقایسه عمق پوسیدگی دندان‏ها در حضور محلول‌های مختلف مورد مطالعه

 


جدول 2 : مقایسه دو به دوی عمق پوسیدگی دندان‌ها در گروه‏های آزمایشی مختلف توسط آزمون توکی

گروه‏های آزمایشی

میانگین اختلاف

P-value

نرمال سالین با چای سبز

00/19

205/0

نرمال سالین با فلوراید

00/52

000/0

نرمال سالین با کلرهگزدین

00/39

000/0

نرمال سالین با فلوراید کلرهگزدین

00/50

000/0

چای سبز با فلوراید

00/33

000/0

چای سبز با کلرهگزدین

00/20

016/0

چای سبز با فلوراید کلرهگزدین

00/31

000/0

فلوراید کلرهگزدین

00/13-

384/0

فلوراید با فلوراید کلرهگزدین

00/2-

999/0

کلرهگزیدین با فلوراید کلرهگزدین

00/11

259/0

 


بحث

چای سبز که در واقع برگ چای سبز تخمیر نشده است حاوی مقادیر قابل توجهی مواد آنتی اکسیدان و ضدالتهابی است(13) که اثرات بازدارنده آن بر رشد استرپتوکوک اولین بار در سال 1989 توسط Toda و همکارانش نشان داده شد(14) و سال‏ها بعد اثر ضدپوسیدگی آن در مطالعات مختلف تآیید شد.(16و15) عصاره پلی‏فنول چای سبز به عنوان منبعی از کاتچین و تیافلاوین است که مانع از رشد و همچنین چسبندگی استرپتوکوک موتانس روی سطح دندان می‏شود. به نظر می‏رسد این اثر ناشی از مهار فعالیت آنزیم گلوکوزیل ترانسفراز استرپتوکوک موتانس توسط پلی‏فنول‏ها باشد.(17)

از آن جائی که ترکیبات پلی‏فنول چای سبز به عنوان ترکیب ضدباکتری آن معرفی شده است(18)، در این مطالعه بر آن شدیم تا اثر ضدپوسیدگی عصاره پلی‏فنول چای سبز را با دهانشویه‌های ضدپوسیدگی رایج در بازار (فلوراید 05/0%، کلر هگزیدین 02/0%)، ترکیب فلوراید-کلرهگزیدین و نرمال سالین به عنوان محلول کنترل، در محیط آزمایشگاه مورد مقایسه قرار دهیم. نتایج این مطالعه نشان داد که کمترین عمق پوسیدگی مربوط به محلول فلوراید 05/0% می‏باشد و پس از آن به ترتیب دهانشویه ترکیبی‌ فلوراید-کلرهگزیدین، کلرهگزیدین 2/0%، عصاره پلی‏فنول چای سبز و نرمال سالین کمترین عمق پوسیدگی را داشتند. به طوری که عمق پوسیدگی ایجاد شده پس از قرارگیری نمونه‏ها در معرض محلول‏های فلوراید-کلرهگزیدین، فلوراید 05/0% و کلرهگزیدین 2/0% تفاوت آماری معنی‏داری را با نتایج حاصل از عصاره پلی‏فنول چای سبز و نرمال سالین نشان داد ولیکن با وجود تفاوت در عمق پوسیدگی بعد از شستشو با این سه محلول، اختلاف آماری معنی‏داری بین عمق پوسیدگی در این سه گروه آزمایشی دیده نشد.

در این مطالعه دندان‏ها به مدت 21 روز در محیط پوسیدگی‏زا قرار گرفتند تا علاوه بر این که عمق پوسیدگی کافی جهت بررسی هیستولوژیک ایجاد شود، از تخریب بیش از حد ساختار دندان که مانع از تهیه برش‏های مناسب می‏شود نیز جلوگیری شود.(19) ضمن اینکه برای اطمینان از عدم آلودگی محیط با هر نوع میکروارگانیسمی که می‏توانست باعث مخدوش شدن نتایج مطالعه شود، نمونه‏ایی از محیط پوسیدگی‏زا هر دو روز یک بار کشت می‏شد. در مطالعه حاضر برای بررسی بروز پوسیدگی از روش هیستوپاتولوژی که دقیق‏ترین متد ارزیابی است، استفاده شد.

Koyama و همکارانش(20) نشان دادند که میزان پوسیدگی دندان‏های افراد با میزان مصرف چای سبز ارتباط دارد. Ferrazanno و همکارانش(21) در مطالعه خود بیان کردند که پلی‏فنول چای سبز با مهار استرپتوکوک‏های دهان باعث پیشگیری از پوسیدگی می‏شود. Suyama و همکارانش(22) نشان دادند که جویدن آدامس‏های حاوی فلوراید استخراج شده از چای سبز، باعث مهار اروژن‏های ناشی از اسید و رمینرالیزاسیون دندانی می‏شود. Linke و همکارش(23) نشان دادند که مصرف چای سبز باعث کاهش بروز پوسیدگی در موش‏های تحت رژیم غذایی پوسیدگی‏زا می‏شود. Subramaniam و همکارانش(13) در مطالعه اثر چای سبز روی رشد استرپتوکوک موتانس، چنین نتیجه گیری کردند که استفاده از محلول آبی یا الکلی برگ چای سبز باعث مهار رشد این باکتری پوسیدگی‏زا می‏شود. آنها در مطالعه خود چنین نتیجه‏گیری کرد که میزان اثر باز دارنده عصاره چای سبز روی رشد استرپتوکوک موتانس از کلرهگزیدین 2/0% بیشتر است. ما در مطالعه حاضر علاوه بر استرپتوکوک موتانس از لاکتوباسیل در محیط پوسیدگی‏زا نیز استفاده نمودیم که اثر مهاری عصاره چای سبز روی این باکتری به عنوان جزء مهمی در پیشرفت پوسیدگی در مطالعه Subramaniam بررسی نشده است.

بر اساس جستجوی انجام شده، مقاله‏ایی که اثر ضدپوسیدگی عصاره پلی‏فنول چای سبز را با فلوراید یا کلرهگزیدین مقایسه کند، انجام نشده است. برخلاف نتایج مطالعات قبلی ذکر شده، در مطالعه حاضر شستشو با عصاره پلی‏فنول چای سبز باعث کاهش معنی‏دار عمق پوسیدگی نشد. علت اختلاف نتیجه با مطالعه Koyama(20) می‏تواند در روش انجام مطالعه باشد. از جمله این تفاوت‏ها می‏توان به کاربرد محدود چای سبز (یک بار در روز) در مطالعه حاضر و تکرر استفاده از آن در مطالعه وی اشاره کرد. از دیگر تفاوت‏های متد مطالعه حاضر با روش مطالعه قبلی شستشو با نرمال سالین است. هرچند نرمال سالین خاصیت ضدپوسیدگی ندارد، ولی خاصیت شویندگی (Flushing effect) می‏تواند تا حدودی در کاهش پلاک میکروبی موثر باشد.(24) Suyama(22) در مطالعه خود از آدامس‏های حاوی فلوراید چای سبز استفاده کرد. یکی از عوامل احتمالی اثربخشی این آدامس‏ها ممکن است اثر فلوراید و نه تنها چای سبز در پیشگیری از پوسیدگی باشد. ضمن اینکه متد اجرائی مطالعه حاضر که بر روی عمق پوسیدگی به لحاظ هیستولوژیک پرداخت و تنها اثر کلینیکی این دهانشویه‏ ها را بررسی نمی‏کرد نیز می‏تواند از حاصل نتایج متناقض این مطالعه با مطالعات قبلی باشد. به هر حال مطالعه اثر ضدپوسیدگی عصاره پلی‏فنول چای سبز در حجم نمونه بیشتر، غلظت‏های بالاتر عصاره پلی‏فنول و استفاده مکرر از آن در آینده برای کسب نتایج دقیق‏تر ضروری به نظر می‏رسد.

نتیجه گیری

براساس نتایج مطالعه حاضر، عصاره پلی‏فنول چای به عنوان یک ترکیب طبیعی نسبت به مواد سنتتیک رایج به عنوان دهانشویه نظیر دهانشویه‏ های فلوراید و کلرهگزیدین در مهار فرایند پوسیدگی ضعیف‏تر بود و برای این که بتوان از چای سبز به عنوان یک ماده ضدپوسیدگی طبیعی موثر نام برد تحقیقات بیشتری لازم است.

تشکر و قدردانی

این مقاله از پایان نامه دوره عمومی دندانپزشکی به شماره ثبت 667 در کتابخانه دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی همدان استخراج گردیده است. ضمناً از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی همدان که هزینه‏های این طرح را تامین نمودند، تقدیر و تشکر می‏گردد.

  1. Dean JA, Avery DR, Mc Donald RE. Dentistry for the Child and Adolescent. 9th ed. London: Mosby Co; 2011. P. 177.
  2. Pakshir HR. Oral health in Iran. Int Dent J 2004; 54(6): 367-72.
  3. Hessari H, Vehkalahti MM, Eghbal M, Heikki T. Oral health and treatment needs among 18-year-old Iranians. Med Princ Pract 2008; 17(4): 302-7.
  4. Hessari H, Vehkalahti MM, Eghbal M, Heikki T. Oral health among 35- to 44-year-old Iranians. Med Princ Pract 2007; 16(4): 280-5.
  5. Goldstep F. Proactive intervention dentistry: A model for oral care through life. Compend Contin Educ Dent 2012; 33(6): 394-6.
  6. Liu BY, Lo EC, Chu CH, Lin HC. Randomized trial on fluorides and sealants for fissure caries prevention. J Dent Res 2012; 91(8): 753-8.
  7. Esfahanian V, Ketabi M, Farman Ara H. Efficacy of Chlorhexidine and Irsha (anti-plaque) mouthrinses on reducing dental plaques. Journal of Isfahan Dental School 2007; 3(1): 10-4. (Persian)
  8. Newman MG, Takei H, Klokkevold PR, Carranza FA. Curranza's Clinical Periodontology. 11th ed. St. Louise: Elsevir; 2011. P. 70.
  9. Feng Q, Kumagai T, Torii Y, Nakamura Y, Osawa T, Uchida K. Anticarcinogenic antioxidants as inhibitors against intracellular oxidative stress. Free Radic Res 2001; 35(6): 779- 88.
  10. An BJ, Kwak JH, Son JH, Park JM, Lee JY, Jo C, et al. Biological and antimicrobial activity of irradiated green tea polyphenols. Food Chem J 2004; 88(4): 549- 55.
  11. Percival RS, Devine DA, Duggal MS, Chartron S, Marsh PD. The effect of cocoa polyphenolson the growth, metabolism, and biofilm formation by Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis. Eur J Oral Sci 2006; 114(4): 343-8.
  12. Attam K, Talwar S, Yadav S, Miglani S. Comparative analysis of the effect of autoclaving and 10% formalin storage on extracted teeth: A microleakage evaluation. J Conserv Dent 2009; 12(1): 26-30.
  13. Subramaniam P, Eswara U, Maheshwar Reddy KR. Effect of different types of tea on Streptococcus mutans: An in vitro study. Indian J Dent Res 2012; 23(1): 43-8.
  14. Toda M, Okubo S, Ohnishi R, Shimamura T. Antibacterial and bactericidal activities of Japanese green tea. Nippon Saikingaku Zasshi 1989; 44(4): 669-72.
  15. You SQ. Study on feasibility of Chinese green tea polyphenols (CTP) for preventing dental caries. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi 1993; 28(4): 197-9, 254.
  16. Otake S, Makimura M, Kuroki T, Nishihara Y, Hirasawa M. Anticaries effects of polyphenolic compounds from Japanese green tea. Caries Res 1991; 25(6): 438-43.
  17. Ferrazzano GF, Amato I, Ingenito A, De Natale A, Pollio A. Anti-cariogenic effects of polyphenols from plant stimulant beverages (cocoa, coffee, tea). Fitoterapia 2009; 80(5): 255-62.
  18. Yoshino K, Nakamura Y, Ikeya H, Sei T, Inoue A, Sano M, et al. Antimicrobial activity of tea extracts on cariogenic bacterium (Streptococcus mutans). J Food Hyg Soc Japan 1996; 37(2): 104-8.
  19. Kiani L. Effect of honey, glucose and fructose on enamel demineralization depth. [Doctorate Thesis]. Iran. Dental School of Hamadan University of Medical Sciences; 2012.
  20. Koyama Y, Kuriyama S, Aida J, Sone T, Nakaya N, Ohmori-Matsuda K, et al. Association between green tea consumption and tooth loss: Cross-sectional results from the Ohsaki Cohort 2006 Study. Prev Med 2010; 50(4): 173-9.
  21. Ferrazzano GF, Roberto L, Amato I, Cantile T, Sangianantoni G, Ingenito A. Antimicrobial properties of green tea extract against cariogenic microflora: An in vivo study. J Med Food 2011; 14(9): 907-11.
  22. Suyama E, Tamura T, Ozawa T, Suzuki A, Iijima Y, Saito T. Remineralization and acid resistance of enamel lesions after chewing gum containing fluoride extracted from green tea. Aust Dent J 2011; 56(4): 394-400.
  23. Linke HA, LeGeros RZ. Black tea extract and dental caries formation in hamsters. Int J Food Sci Nutr 2003; 54(1): 89-95.
  24. Roberson TM, Heymann HO, Swift EJ. Art and Science of Operative Dentistry. 5th ed. St. Louis: Mosby Co; 2006. P. 112-3.